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第一部分CaV1.3在听觉通路中的表达与年龄的相关性目的:探究CaV1.3钙离子通道蛋白在不同年龄阶段C57BL/6J雄性小鼠中听觉通路中的表达情况,评估CaV1.3在听觉通路中的表达与年龄是否具有相关性。方法:运用免疫荧光、PCR、western-blotting、流式细胞术等检测方法评估CaV1.3在C57BL/6J雄性小鼠耳蜗和听觉中枢通路中的年龄相关性表达。运用流式细胞术检测技术特异性标记神经元细胞为NeuN+,进一步证实CaV1.3在听皮层神经元中的特异性表达。结果:免疫荧光结果显示CaV1.3在耳蜗毛细胞和螺旋神经细胞中的表达随着年龄增长逐渐降低。PCR、western-blotting和流式细胞术结果显示其在听皮层中总的表达在16周之前表达增加而在16周之后表达减少。运用流式细胞术检测技术特异性标记神经元细胞后,发现听皮层来源的神经元中表达的CaV1.3在不同年龄组之间没有显著性差异。PCR结果显示CaV1.3在下丘和耳蜗核中的mRNA表达水平的表达随着年龄变化没有显著差异。结论:CaV1.3钙离子通道蛋白在耳蜗中的表达随着年龄的增长呈逐渐下降的趋势,这表明CaV1.3表达下调可能与年龄相关性听力损失具有相关性。这为进一步研究年龄相关性听力损失提供了新的研究思路,为预防老年性聋提供了潜在的靶点。第二部分CaV1.3下调对毛细胞衰老的影响目的:构建CaV1.3细胞敲除稳转细胞系,建立成熟的HEI-OC1毛细胞衰老诱导模型,利用体外细胞相关实验,探究CaV1.3下调对体外毛细胞系衰老的影响,利用Corti’s器组织培养技术及AAV转染技术在体验证CaV1.3下调对内耳毛细胞及年龄相关性听力损失的影响。方法:运用Crisper/Cas9敲除技术构建CaV1.3敲除的稳转HEI-OC1细胞株,并且通过流式细胞术证实敲除效果。运用膜片钳技术检测CaV1.3敲除后MP、平均NLCmax发生的变化。运用H2O2建立HEI-OC1毛细胞系衰老诱导模型,通过P53检测,C12FDG染色和β-半乳糖苷酶染色验证衰老诱导的效果。野生型HEI-OC1与CaV1.3 KO型HEI-OC1细胞系经H2O2衰老诱导处理后,运用C12FDG染色和β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老诱导的效果,运用CFSE染色和Red Dot染色检测细胞的增殖情况,LDH和Caspase-3/7-AAD染色检测细胞的凋亡和死亡情况。利用AAV经听泡穿刺注射法构建CaV1.3敲降模型鼠后,用D-半乳糖诱导野生型和CaV1.3-knock down型C57BL/6J小鼠建立衰老模型,评估小鼠听性脑干反应（auditory brainstem response,ABR）,基底膜铺片染色观察毛细胞缺失情况。体外分离培养新生小鼠（P3-P5）的Corti’s（OC）器官,运用AAV敲降CaV1.3,经H2O2衰老诱导处理后,染色观察毛细胞缺失情况。结果:流式细胞术结果显示运用Crisper/Cas9敲除技术构建的CaV1.3敲除HEI-OC1细胞株中CaV1.3的表达较野生型HEI-OC1细胞明显下降。膜片钳结果发现CaV1.3敲除后细胞膜电位下降,平均NLCmax增高。P53检测,C12FDG染色和β-半乳糖苷酶染色证实了细胞衰老诱导的效果。流式细胞术结果观察到,在衰老细胞中CaV1.3的表达增高。经低剂量H2O2衰老诱导处理后,与野生型HEI-OC1相比,（1）C12FDG染色和β-半乳糖苷酶染色检测发现CaV1.3 KO型HEI-OC1细胞衰老细胞明显增多;（2）CaV1.3 KO型HEI-OC1细胞CFSE染色显示细胞增殖减弱,Red Dot检测发现S期阻滞显著增多;（3）KO型HEI-OC1细胞上清液中释放的LDH显著增加,Caspase-3/7-AAD染色进一步证实了这一结果。听泡穿刺注射AAV后,免疫荧光结果显示knock down AAV组较对照组CaV1.3荧光强度明显减弱,ABR检测结果显示,衰老诱导后ABR特征波形降低,CaV1.3敲降加重了这种效应,而单独敲降不影响ABR结果。基底膜铺片结果显示,诱导衰老后可以观察到轻微的毛细胞缺失,CaV1.3敲降后毛细胞的缺失增加。Corti’s器组织培养结果验证了这一效应。结论:本研究成功构建了CaV1.3敲除的稳转HEI-OC1细胞株,建立了成熟的H2O2细胞衰老诱导模型,利用体外细胞相关实验发现,经H2O2诱导细胞凋亡后,与野生型HEI-OC1相比,CaV1.3KO型HEI-OC1细胞对H2O2衰老诱导的易感性明显增强,并伴随细胞增殖停滞和S期阻滞显著增多。这表明CaV1.3表达下调或敲除会导致毛细胞对ROS的损伤易感性增强。体外实验结果进一步验证CaV1.3敲降本身不会导致毛细胞损失,而CaV1.3的下调可加重衰老诱导后毛细胞缺失,进而加剧听力受损。第三部分CaV1.3下调促进毛细胞衰老的具体机制目的:氧化应激和线粒体功能障碍在衰老中发挥了主要作用,年龄相关性听力损失也可以由活性氧和线粒体功能障碍引起,氧化应激、改变抗氧化酶水平以及降低复合物Ⅰ,Ⅱ,Ⅳ的活性等可以诱发细胞凋亡。基于此本研究进一步探究CaV1.3下调促进毛细胞衰老的具体作用机制。方法:CaV1.3敲除后,运用DCFH-DA探针检测HEI-OC1细胞内ROS的表达变化,用钙离子载体Ionmycin处理后,运用3-AM探针和DCFH-DA探针检测胞内钙离子浓度和ROS的变化,Caspase-3/7-AAD染色后流式细胞术方法检测细胞凋亡情况,C12FDG染色检测细胞衰老情况,通过Mito Tracker和mito SOX共染色,检测CaV1.3敲除后线粒体来源的ROS变化情况。运用不同梯度浓度复合物Ⅰ抑制剂Retenone和复合物Ⅲ抑制剂抗霉素A处理后,经DCFH-DA探针染色,检测细胞内ROS的含量变化。结果:本研究发现CaV1.3敲除后,HEI-OC1细胞内钙离子浓度降低,同时细胞内ROS显著上调。而运用钙离子载体Ionmycin后,细胞内钙离子水平部分恢复,同时伴随细胞内ROS的减少。ROS介导的细胞凋亡和衰老也得到部分缓解。MitoTracker和mito SOX共染荧光结果显示CaV1.3敲除后,线粒体来源的ROS增加。运用复合物Ⅰ抑制剂Retenone后,在CaV1.3敲除的毛细胞中观察到剂量依赖性ROS降低,但复合物Ⅲ抑制剂抗霉素A则不能影响CaV1.3敲除诱导的ROS上调。结论:CaV1.3敲除诱导ROS上调部分原因是细胞内钙离子的减少。CaV1.3敲除引起细胞内钙离子浓度减少,随后导致毛细胞线粒体复合物Ⅰ来源的ROS灭活减少,最终导致细胞内ROS增加而促进衰老。CaV1.3敲降加重了衰老诱导后毛细胞的丢失,从而促进年龄相关性听力损失,这可能为预防ARHL提供了潜在的靶点。