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菊花(Chrysanthemum ×morifolium Ramat.)是起源于中国的世界名花,其产值和产量在世界花卉产业中始终位居前列。开花期是观赏植物重要的栽培特性,也是影响花卉产业化生产的关键因素之一。菊花为典型的短日植物(Short-day plant,SDP),自然开花期主要集中于秋季,这使其周年生产和园林应用受到一定的局限。目前,菊花的周年生产主要利用其响应短日照诱导成花的特性通过遮光和补光的方法调控开花时间以适应市场需求,这种方法极为耗能。因此,研究菊花响应短日照成花的机制,培育快速响应光周期诱导成花的菊花新品种是亟待解决的问题。作为一类重要的光受体,光敏色素参与调控高等植物的开花时间调控主要通过光周期途径中对CO蛋白稳定性及FT转录水平的调控实现,而在已知的6种开花途径的相互整合上,光敏色素则发挥了更重要的作用。已有研究表明,光敏色素(Phytochrome,PHY)在长日植物拟南芥中具有调控开花时间的功能,基因家族PHY4、PHYB、PHYC、PHYD和PHYE不同成员间既相互独立,又存在功能冗余,PHYA和PHYB是光敏色素基因家族的最早分支成员,具有更高的保守性。拟南芥中PHYA主要参与植物的避阴反应,而PHYB除了避阴反应还在调控开花时间中发挥不同的功能,但其在短日植物开花调控上的功能尚待深入研究。本研究以参与栽培菊花起源的菊属近缘野生种二倍体甘菊(C lavandulifolium)和六倍体毛华菊(C.vestitum)为试验材料,在确认其响应短日照开花特性的基础上,克隆PHYA和PHYB基因全长并分析基因组织特异性及响应光周期的表达模式,进而克隆启动子序列分析预测可能的保守调控元件,最后利用农杆菌介导法将ClPHYB转化野生型和缺失突变体拟南芥以初步解析其功能。本研究获得的主要结果如下:1.结合甘菊和毛华菊转录组数据库,利用3’RACE技术的方法克隆得到甘菊和毛华菊PHYA和PHYB基因,分别命名为ClPHYA、ClPHYB和CvPHYA、CvPHYB。C1PHYA和CvPHYA均包含3366 bp的开放阅读框,编码1121个氨基酸残基;C1PHYB和CvPHYB分别包含3394 bp和3357 bp的开放阅读框。多序列比对发现C1PHYA和CvPHYA序列相似性为99.82%,ClPHYB和CvPHYB序列相似性为78.36%。系统进化分析发现蛋白分为2支··PHYA蛋白和PHYB蛋白,并且科属相近的植物聚在一起。甘菊、甘野菊(C.seticuspe)和毛华菊聚在一支。2.甘菊和毛华菊PHYA和PHYB基因表达的组织特异性及光周期响应特点分析表明,甘菊ClPHYA、ClPHYB和毛华菊CvPHYA、CvPHYB均为在叶片中的表达水平最高。甘菊ClPHYA、ClPHYB和毛华菊CvPHYA、CvPHYB均可响应短日照诱导表达,表达模式有一定的相似性。随着短日照诱导时间的延长,甘菊ClPHYA和毛华菊CvPHYA的表达丰度逐渐升高,在短日照诱导16-20 d时出现表达高峰,进而表达丰度下降。甘菊ClPHYB和毛华菊CvPHYB的表达丰度先随短日照诱导时间的延长逐渐降低,在12-16d表达量降低,推测该基因表达和功能可能在短日照菊属植物中较为保守性。3.利用染色体步移法克隆获得了甘菊ClPHYA基因5’端696 bp和ClPHYB基因5’端901 bp调控序列,启动子保守元件预测结果表明,ClPHYA启动子包括多个光响应元件,如Box 4,P-box,chs-CMA2a等;ClPHYB基因启动子也包括多个光响应元件,如 ATCT-motif、BoxII、G-box、GA-motif、I-box、LAMP-element、chs-CMA2b等,二者还包含多个与激素相关的作用元件和参与干旱诱导MYB结合位点MBS等其他顺势作用元件,说明甘菊ClPHYA和ClPHYB基因表达都有可能受光周期、生长发育和赤霉素GA、生长素等植物激素的调控,但二者启动子上包含的顺式作用元件数量及种类上存在明显的差异。4.鉴于PHYB除了参与避阴反应,还在调控开花时间中发挥不同的功能,且系统进化分析发现短日照甘菊ClPHYB与长日照拟南芥AtPHYB亲缘关系较远,故为进一步研究ClPHYB的基因功能,利用农杆菌转化pBI121m-ClPHYB过表达载体,侵染野生型和PHYB突变体phyb-1拟南芥,共得到35S::ClPHYB/Col-0 T1代3个株系和相35S::ClPHYB/phyb T1代2个株系。白光下35S::ClPHYB/Col-0拟南芥的下胚轴长度缩短。长日照条件下Col-0、35S::ClPHYB/Col-0和35S::ClPHYB/phyb-1转基因拟南芥开花时间不存在显著差异;短日照条件下35S::ClPHYB/Col-0与Col-0相比,拟南芥开花时间平均延迟15 d,而35S::ClPHYB/phyb-l与Col-0相比开花时间无显著差异。基因表达分析发现,过表达ClPHYB能够下调CO和FT的表达水平。此外,35S::ClPHYB/Col-0转基因拟南芥莲座叶数量减少、叶片及叶柄长度缩减、植株矮化、叶片深绿、表皮毛密度增加。上述研究结果表明,甘菊和毛华菊叶片中的光敏色素响应短日照诱导表达,菊ClPHYA、ClPHYB和毛华菊CvPHYA、CvPHYB短日条件下表达模式具有一定的相似性,均响应短日照表达,且PHYA和PHYB之间的表达模式呈现一定程度的负相关,推测这两个基因在短日照菊属植物间较为保守。转基因结果表明,ClPHYB可显著推迟短日照下拟南芥植株的开花时间并会抑制避阴性反应,而在长日照下影响甚微,推测ClPHYB是短日照开花的抑制因子。本研究初步解析了ClPHYB的基因功能,ClPHYB是通过分子手段干预光周期途径上游的光信号感知过程进而改良开花期的潜在目标基因。