肠黏膜屏障是保护机体免遭外源病原物侵袭的重要屏障。主要由上皮细胞通过紧密连接蛋白连接而成,其中紧密连接蛋白(Tight junction proteins,TJs)是构成上皮屏障的物质基础,主要负责细胞的溶质转运,且在调节细胞分化和通透性方面发挥重要作用。紧密连接蛋白异常将引发肠黏膜屏障结构和功能的改变,炎症性肠病、自体免疫病、高血脂等多种疾病的发生发展都与之有关。因此,探索肠黏膜屏障的分子损伤与保护机制及开发相关防护产品意义重大。我国传统的具有胃肠道保护性,药食同源物质陈皮具有多种生物学活性,如抗氧化、抗炎、抗肿瘤等。本实验室先前的研究中证实陈皮中含量最丰富的代表性多甲氧基黄酮-川陈皮素(Nobiletin,NOB)具有良好的抗炎作用。本研究中我们聚焦于陈皮保护肠黏膜稳定的可行性及其机制。本研究中,我们首先构建大鼠肠上皮细胞层来模拟体外肠黏膜屏障,验证陈皮及NOB对是否对其具有保护作用,利用跨上皮电阻(Trans-epithelium electrical resistance,TEER)检测大鼠上皮细胞层的完整情况。我们发现陈皮及NOB能阻止炎性刺激对大鼠肠上皮细胞层通透性的损伤,提示陈皮及NOB可能对肠黏膜屏障具有保护作用。于是,我们利用葡聚糖硫酸钠盐(Dextran sulfate sodium salt,DSS)诱发的小鼠炎症肠病模型进行体内实验,将小鼠随机分为空白对照组、DSS处理组、0.01%NOB组、10%陈皮组四组,每组12只。空白对照组饮食正常,其余三组在饮用含3%DSS的水的同时分别食用正常饲料、含0.01%NOB、10%陈皮的饲料,结果表明陈皮及NOB可以显著抑制DSS导致的小鼠体重下降、结肠变短、便溏甚至血便的现象。此外,异硫氰酸荧光素(FITC)实验证实无论是0.01%NOB还是陈皮均可以显著改善DSS造成的小鼠肠黏膜屏障破坏,进一步表明陈皮及NOB对小鼠肠黏膜屏障具有良好的保护作用。此外,我们还通过对小鼠的结肠进行苏木素-伊红染色组织学分析,确认陈皮及NOB都可以抑制DSS引起的小鼠肠绒毛长度缩短及结构破坏。以上的结果表明,陈皮及NOB对小鼠肠黏膜屏障有良好的保护作用。为了探究陈皮及NOB保护小鼠肠黏膜屏障的作用机制,我们通过实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测了一系列肠上皮细胞紧密连接蛋白表达情况,结果发现在小鼠结肠中DSS处理可导致Claudin蛋白家族成员claudin-7(CLDN7)显著下调,而0.01%NOB及陈皮均可以逆转DSS诱导的claudin-7表达抑制。从理论上讲,肠上皮细胞分化过程中claudin-7的表达通常受核受体肝细胞核因子(Hepatocyte nuclear factor 4 alpha,HNF4-α)转录调控。为了验证HNF4-α-claudin-7这一信号途径是否涉及到陈皮或NOB的保护机制,我们首先利用RT-PCR和免疫组化检测了HNF4-α在小鼠结肠中的表达,表明陈皮及NOB可以显著上调HNF4-α的表达。为了进一步验证NOB诱导HNF4-α对claudin-7的转录调控,我们用RNA干扰技术在人结肠癌细胞系HT-29对HNF4-α进行特异性敲降(knock-down)处理,结果发现HNF4-α敲降后能够显著抑制NOB诱发的claudin-7表达。此外,进一步的荧光素酶报告实验表明,突变claudin-7启动子中的HNF4-α结合位点的载体活性较野生型构建体更低。综上,我们的研究结果表明陈皮及其代表性多甲氧基黄酮NOB通过诱导HNF4-α对claudin-7的转录调控来实现保护肠黏膜屏障完整的作用。