邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）暴露可以导致雄性生殖毒性,影响精子发生过程。但目前关于DEHP暴露致雄性生殖毒性的研究主要集中在DEHP暴露对睾丸组织及生精细胞的氧化应激、凋亡的影响和对精子质量等的研究,对于DEHP致精子发生障碍的机制认识尚浅,不能深刻揭示DEHP暴露对生精细胞的影响,例如,减数分裂作为精子发生过程的重要一环,DEHP暴露对精母细胞生理过程有何影响尚不明确。N6-甲基腺苷（m6A）作为转录后修饰对调节基因表达至关重要,且已有研究表明m6A调控精子发生过程的正常进行,对精子发生而言不可或缺。但m6A在DEHP暴露致精母细胞损伤中的调控作用仍有待探索。本研究拟通过体外细胞实验,从表观遗传角度探讨m6A在DEHP诱导小鼠精母细胞基因毒性中发挥的作用,从而深入研究DEHP致精子发生障碍的毒作用机制。通过建立小鼠精母细胞GC-2的DEHP暴露模型,观察DEHP对GC-2细胞的DNA复制活性的影响,并结合对细胞周期、细胞内活性氧（ROS）检测,以了解DEHP对GC2-细胞的基因毒性,并探讨相应毒性机制;在此基础上,检测了GC-2细胞内DNA双链断裂（DSBs）的水平及细胞对DSBs的可能修复途径,进一步探索DEHP对GC-2细胞基因组的影响;并通过观测DEHP暴露GC-2细胞模型中总RNA的m6A甲基化修饰水平的改变,DEHP暴露对GC-2细胞内m6A相关蛋白表达的影响,分析DNA损伤相关RNA的m6A修饰水平变化与DEHP诱导DNA损伤反应（DEHP-induced DDR）之间的关系,以探讨RNA表观遗传在DEHP致GC-2细胞基因毒性中的作用机制。本研究的主要内容如下:一、DEHP暴露诱发GC-2细胞DNA双链断裂本研究使用小鼠精母细胞GC-2模型,给予50μM、100μM、200μM、300μM和400μM的DEHP暴露24h,通过对细胞增殖、活力的检测,探究DEHP对GC-2细胞的一般毒性效应;结合Ed U实验分析DEHP暴露对GC-2细胞的DNA复制活性的影响;进一步通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测DEHP暴露GC-2细胞内ROS水平;通过q PCR实验检测与细胞周期、DNA损伤反应（DDR）相关基因的m RNA表达量;通过Western Blot及细胞免疫荧光实验检测DDR相关的蛋白表达量及细胞内定位。实验结果表明,DEHP暴露显著抑制GC-2细胞的增殖能力,且经流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测,发现DEHP诱导GC-2细胞内产生大量的ROS,表明细胞内氧化应激水平升高。Ed U实验发现DEHP暴露导致GC-2细胞的DNA复制活性被显著抑制,表明DEHP可能对GC-2细胞的基因组稳定性及完整性有损害作用,基于此,本研究进一步通过流式细胞术检测了细胞周期,发现DEHP暴露导致GC-2细胞周期被阻滞在G0/G1期,过渡至S期的细胞量明显减少,表明GC-2细胞为了防止DEHP诱导的基因组损伤被传递下去,通过自身调节细胞周期,将细胞周期阻滞于G0/G1期对受损DNA进行修复。在进一步检测DEHP对基因组的损害后,发现GC-2细胞出现了DEHP暴露诱导的DSBs（DEHP-induced DSBs）,并且RAD51及XRCC5两种修复因子由于DEHP的暴露而表达上调,并与DSBs标志物γH2AX出现共定位,表明在DEHP-induced DDR中同源重组（HR）和非同源末端结合（NHEJ）两种修复途径参与GC-2细胞对DEHP-induced DSBs的修复过程中。二、m6A参与GC-2细胞内DEHP-induced DNA损伤反应已有研究表明环境内分泌的干扰物暴露可影响组织细胞内m6A甲基化修饰水平,且m6A在DEHP及其代谢物邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（MEHP）致雄性生殖毒性中发挥作用,但具体作用机制仍不清楚。本研究通过Dot Blot实验检测DEHP暴露GC-2细胞的总RNA的m6A甲基化修饰水平;q PCR和Western Blot检测m6A相关调节因子的m RNA及蛋白表达水平;经免疫荧光实验检测m6A修饰的RNA、METTL3和YTHDC1与γH2AX的细胞内定位情况等来分析m6A在GC-2细胞内DEHP-induced DDR中发挥的作用。研究结果表明,100μM和200μM的DEHP暴露显著上调了GC-2细胞内总RNA的m6A甲基化修饰水平,m6A甲基转移酶METTL3及m6A结合蛋白YTHDC1的表达量亦因DEHP暴露而显著上调。提示METTL3由于DEHP暴露而被募集至DNA损伤位点,这表明METLL3可能参与了GC-2细胞对DEHP-induced DSBs的修复过程。而METTL3作为m6A甲基化修饰的调节因子,我们推测m6A甲基化修饰可能参与对DEHP-induced DSBs的修复过程。经检测发现细胞核内m6A甲基化修饰的DNA损伤相关RNA与DSBs标志物γH2AX形成了共定位,这表明m6A甲基化修饰可能在GC-2细胞DEHP-induced DDR中发挥重要作用,并参与对DSBs的修复。YTHDC1作为m6A结合蛋白,负责m6A甲基化修饰位点的识别并介导m6A生理功能的发挥,实验结果表明DEHP暴露显著上调YTHDC1的表达水平,并使YTHDC1与γH2AX形成共定位,这表明在YTHDC1可能由于DEHP暴露而被募集至DNA损伤位点并介导了m6A甲基化修饰的RNA在GC-2细胞内对DEHP-induced DSBs的修复。本研究结果表明DEHP暴露诱导GC-2细胞发生DSBs,总RNA的m6A甲基化修饰水平升高,且DNA损伤相关RNA的m6A甲基化修饰及其调节因子可能在GC-2细胞内DEHP-induced DDR中发挥作用从而参与对受损DNA的修复。