论文部分内容阅读
目的:线粒体功能障碍是心力衰竭形成的重要原因。及时清除功能障碍的线粒体有利于减少氧化应激,促进线粒体膜电位和功能的恢复,改善能量供应,进而保护心肌功能。线粒体自噬是选择性地去除受损线粒体的过程,对于线粒体质量控制至关重要。研究发现慢性间歇性低压低氧(Chronic intermittent hypobaric hypoxia,CIHH)预处理能缩小心肌缺血和/或再灌注梗死面积,改善心肌收缩功能,延缓心力衰竭的发展。但CIHH是否通过对线粒体自噬的调节作用发挥保护作用,尚不明确。由于线粒体自噬受体FUN14相关蛋白1(FUN14 domain containing 1,FUNDC1)是响应低氧应对应激的关键蛋白。因此,本研究探讨FUNDC1在CIHH预处理保护心肌梗死后心功能,延缓心力衰竭的作用和机制。方法:雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组(CON组)、CIHH组(模拟5000米高空的低压低氧4周,每天8小时),心肌梗死(Myocardial infarction,MI)组(小鼠进行心脏冠状动脉左前降支结扎)和CIHH+MI组。每周测定小鼠体重,MI前后行超声心动图评估心功能,测血清心肌损伤标志物和左室心肌组织B型脑钠肽(Brain natriuretic peptide,BNP)表达评估心脏损伤及衰竭程度,苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,H&E染色)和Masson染色分别评估心肌病理变化及梗死纤维化程度。采用蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)和逆转录-聚合酶链反应(Revers transcriptation-Polymerase chain reaction,RT-PCR)检测线粒体自噬受体FUNDC1在梗死后心肌组织的表达,同时在细胞实验中用腺病毒Fundc1-shRNA转染心肌细胞(H9C2)抑制FUNDC1基因表达,观察低氧预处理后FUNDC1水平变化在心肌缺血性损伤的作用。随后用Seahorse测量线粒体耗氧率、流式细胞术测量线粒体活性氧(Reactive oxygen species,ROS)评估线粒体功能。最后采用电镜观察线粒体结构和蛋白免疫印迹观察FUNDC1对自噬相关蛋白、线粒体动力学蛋白的影响。结果:1.CIHH处理后小鼠体重、左心室功能、心肌组织病理学变化:CIHH组小鼠进行4周CIHH处理后小鼠体重变化、心功能测值(射血分数,Ejection Fraction,EF和缩短分数,Fractional shortening,FS)与CON组相比差异无统计学意义;与CON组相比,CIHH组心肌组织行HE染色未观察到病理学损伤变化。2.CIHH对小鼠心肌梗死后左心室心功能参数、心肌损伤标志物和心肌梗死面积的影响:小鼠心肌梗死4周后,与CON组相比,MI组EF和FS测值明显降低(P<0.01);与CIHH组相比,CIHH+MI组EF和FS测值也明显降低(P<0.01);与MI组相比,CIHH+MI组EF和FS测值增加(P<0.05);EF和FS测值在CON组和CIHH组差异无统计学意义(P>0.05);同样,小鼠血清中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)在CON组和CIHH组差异无统计学意义(P>0.05),分别与MI组和CIHH+MI组相比,后两组LDH、CK-MB水平明显升高(P<0.01);与MI组比,CIHH+MI组LDH和CK-MB表达水平减少(P<0.05);与CON组比,MI组BNP表达明显增加(P<0.01);与MI组比,CIHH+MI组BNP表达减少(P<0.05);与CON组相比,MI组心梗面积增大(P<0.01);与CIHH组相比,CIHH+MI组心梗面积增大(P<0.01);然而与MI组相比,CIHH+MI组心梗面积减小(P<0.01)。3.心肌组织中FUNDC1蛋白和mRNA的表达:与CON组相比,CIHH组FUNDC1蛋白及mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05);与CON组相比,MI组FUNDC1蛋白及mRNA表达减少(P<0.05);与MI组相比,CIHH+MI组FUNDC1蛋白及mRNA表达明显增加(P<0.01和P<0.05);4.敲低FUNDC1对心肌细胞缺血性损伤的影响:在细胞实验中,使用Fundc1-shRNA敲低FUNDC1,与Control-shRNA组相比,Fundc1-shRNA组FUNDC1基因表达明显减少(P<0.01);敲低FUNDC1进行低氧预处理(Hypoxia preconditioning,HPC)后行慢性低氧葡萄糖剥夺(Oxygen and glucose deprivation,OGD)模拟心肌缺血损伤,与Control-shRNA+HPC+OGD组相比,Fundc1-shRNA+HPC+OGD组FUNDC1蛋白减少(P<0.05);同时在Fundc1-shRNA+HPC+OGD组LDH释放和心肌细胞凋亡增加(P<0.01和P<0.05)。5.FUNDC1表达变化对线粒体功能的影响:与CON组比,CIHH组由谷氨酸诱导的线粒体呼吸控制率差异无统计学意义,在MI组上述线粒体呼吸控制率降低(P<0.01);与MI组相比,CIHH+MI组在谷氨酸诱导的线粒体呼吸控制率增强(P<0.05)。在细胞实验中,敲低FUNDC1,与Control-shRNA+HPC+OGD组相比,Fundc1-shRNA+HPC+OGD组线粒体最大呼吸明显减弱(P<0.01),并且线粒体ROS的生成增加(P<0.01)。6.电镜下线粒体结构的变化:与CON组相比,MI组小鼠心脏组织中的线粒体数量减少(P<0.05),并且线粒体面积异常增大(P<0.01);与CIHH组相比,CIHH+MI组线粒体数量未见减少(P>0.05),线粒体面积相对增大(P<0.01);然而与MI组相比,CIHH+MI组线粒体数量增加(P<0.05),线粒体面积减小(P<0.01);7.线粒体动力学蛋白和自噬水平的变化:线粒体融合蛋白1(Mitochondrial fusion protein 1,MFN1)和线粒体融合蛋白2(Mitochondrial fusion protein 2,MFN2)在CON组、MI组、CIHH组、CIHH+MI组表达差异无统计学意义(P>0.05);与MI组相比,CIHH+MI组线粒体分裂因子1(Mitochondrial fission factor1,FIS1)和动力学相关蛋白1(Dynamin-related protein 1,DRP1)表达增加(P<0.05),线粒体分裂因子(Mitochondrial fission factor,MFF)表达差异无统计学意义(P>0.05);与CON组相比,MI组LC3-Ⅱ蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05),P62蛋白表达增加(P<0.05);与MI组相比,CIHH+MI组LC3-Ⅱ蛋白表达增加(P<0.05),伴随P62蛋白的减少(P<0.01)。结论:1.CIHH处理对正常小鼠左心功能和心肌组织病理学无影响。2.CIHH处理对心肌梗死小鼠心脏具有的保护作用,能显著提高小鼠左心室收缩和舒张功能,降低血清LDH和CK-MB的水平,减少BNP的表达,缩小心肌梗死面积。3.心肌梗死组织FUNDC1表达减少,CIHH处理小鼠心肌梗死心肌组织中FUNDC1表达增加;细胞实验中敲低FUNDC1,增加了低氧预处理后心肌细胞缺血性损伤的细胞凋亡和LDH的释放,逆转了低氧预处理对缺血心肌细胞保护作用。4.心肌梗死组织线粒体呼吸控制率降低,然而CIHH预处理增加了心肌梗死组织线粒体呼吸控制率;敲低FUNDC1减弱线粒体最大呼吸,线粒体ROS的生成增加,表明心肌缺血性损伤导致线粒体功能受损,低氧预处理对缺血性心肌的保护作用可能通过增加FUNDC1改善线粒体的功能。5.心肌梗死组织线粒体数量减少,线粒体面积异常增大,线粒体分裂蛋白(DRP1和FIS1)表达减少,线粒体自噬水平下降;CIHH处理心肌梗死组织线粒体数量未见减少,线粒体面积相对增加,增加了DRP1和FIS1蛋白的表达,线粒体自噬水平增加。本研究表明在心肌梗死后缺血性应激过程中,CIHH处理通过上调线粒体自噬受体FUNDC1表达,促进线粒体自噬,维持线粒体质量稳态,改善线粒体功能,减少线粒体ROS生成,延缓梗死后心功能的恶化。