论文部分内容阅读
目的:当归六黄汤是出自金代李东垣编撰的《兰室秘藏》中的经典名方,本文将建立传统当归六黄汤基准样品的制备工艺以及饮片煎煮工艺,建立当归六黄汤基准样品含量测定方法,进而探究当归六黄汤单煎合煎的不同含量变化,意在说明经典名方传统煎煮合理性以及与配方颗粒的差异性。进而基于网络药理学建立阴虚甲亢大鼠模型,对比当归六黄汤单煎合煎治疗甲亢大鼠的药效作用差异,下一步通过当归六黄汤对肠道菌群丰度及多样性的影响,寻找当归六黄汤引起变化的菌群以及其作用,综合分析传统煎剂对比配方颗粒的合理性,为当归六黄汤的进一步开发研究提供理论依据。方法:（1）通过查阅的文献资料,对七味药材的化学成分进行整理总结;遵循古籍记载,结合现代实际操作,从浸泡时间、粉碎粒度、加热时间、过滤目数、加热方式五个方面,以出膏率、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱及黄芩苷含量、浸出率及特征图谱对比度为指标,确定传统汤剂制备工艺。采用真空冷冻干燥的方式对水煎液进行干燥,得到当归六黄汤基准样品,并依托指标性成分在合理范围内转化为现代饮片煎煮工艺;（2）制备当归六黄汤单煎合煎样品,比较其中表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱及黄芩苷含量变化,比对单煎合煎特征图谱化学成分判断有无新化合物产生;（3）运用TCMSP筛选当归六黄汤的化学成分,使用基因库搜索功能,针对甲状腺亢进病症,获取其相关靶点信息,取交集于药物以及疾病相关靶标基因,使用STRING数据库对筛选出的主要作用靶点构建PPI网络,通过Cytoscape软件构建相应网络图,借助DAVID数据库对当归六黄汤治甲亢相关靶基因进行GO富集分析及KEGG富集分析;（4）建立阴虚甲亢大鼠模型,比较不同给药组给药前后大鼠体质量和粪便含水率差异,并采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清中c AMP（血清环磷酸腺苷）、T3（血清三碘甲状腺原氨酸）、T4（血清甲状腺素）、Cor（血清皮质醇）、ACTH（血清腺皮质激素）、TSH（血清促甲状腺激素）含量变化;（5）采用Pac Bio Sequel测序平台的高通量测序技术,对当归六黄汤单煎合煎治疗甲亢大鼠粪便细菌中的微生物进行分析,明确各组肠道菌群的群落组成和差异菌群。结果:（1）基准样品制备工艺为:将当归、生地黄、熟地黄、黄芩、黄连、黄柏各2.58 g、黄芪5.16 g粉碎过2号筛,加水400 m L,煎煮约20 min,至煎液200 m L,100目过滤,经真空冷冻干燥即得;饮片煎煮工艺:为加八倍量水煎煮60 min,滤过,再加入6倍量水煎煮60 min,滤过,合并煎液即得;（2）采用3种色谱条件测当归六黄汤单煎以及合煎中表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱及黄芩苷含量以及特征图谱。在各色谱条件下,发现与单煎样品相比,当归六黄汤合煎汤剂中黄芩苷、黄连碱、盐酸小檗碱、巴马汀四种成分的含量均在不同程度上有所降低,并且在煎煮过程中,合煎汤剂会形成大量絮状沉淀,出膏率高于当归六黄汤单煎样品。经过特征图谱比对,合煎后未发现明显新峰,单煎溶液和合煎溶液色谱峰化学成分质的表征基本一致,但峰面值有一定差异;（3）通过构建成分-靶点网络找出当归六黄汤中的相关活性成分,通过匹配药物靶点以及疾病靶点,找出治疗甲亢的56个靶点,并且经过蛋白互作网络找到相关性最高的两个靶点白介素6（IL-6）、重组人白介素1β（IL-1β）。通过GO及KEGG富集分析可以得出,当归六黄汤是通过多蛋白、多信号通路来抑制炎症反应、调节激素的分泌,产生抗甲亢等治疗作用;（4）当归六黄汤对甲状腺功能亢进所致的T3、T4、Cor、ACTH、c AMP,ACTH升高以及TSH降低有调节作用,能改善甲亢模型大鼠的整体表现。其中当归六黄汤合煎组中,对甲亢大鼠T3、T4、Cor、ACTH、TSH、c AMP激素调节要优于当归六黄汤单煎组的效果,合煎高剂量组不仅对体重恢复和润肠通便有一定促进作用,还能调节甲状腺激素水平;（5）以甲亢大鼠粪便样本为对象,四组样本的群落分布存在差异,在门水平上,在各组肠道菌群中占绝对优势的为厚壁菌门,其次拟杆菌门、疣微菌门以及软壁菌门为相对丰度较高的门,当归六黄汤合煎组中,厚壁菌门丰度要小于其他三组,疣微菌门丰度要远高于其他三组。在属水平上,甲亢能引起毛螺科菌属丰度增加,Romboutsia属、阿克曼氏菌属、瘤胃球菌属丰度减少,合煎组有益菌群明显高于单煎组。结论:本研究确定了当归六黄汤传统工艺及现代饮片煎煮工艺,基于当归六黄汤在配方颗粒与传统汤剂不同制备方式做对比,从化学成分、主要成分含量对比单煎合煎化学物质变化,通过网络药理学建立阴虚甲亢大鼠药理模型,明确当归六黄汤药效基础,明确了当归六黄汤单煎合煎不同给药组治疗甲亢大鼠的药效作用差异,当归六黄汤合煎组改善肠道有害菌群丰度紊乱,以及促进有益菌生长,调节甲亢大鼠肠道菌群紊乱,所表现出的大便色黑以及干结的现象,恢复肠道微生态,说明当归六黄汤与其调节肠道微生态相关,并且当归六黄汤合煎组作用明显优于单煎组,为经典名方当归六黄汤的药效物质基础研究和临床应用提供理论依据。