背景及目的:人体关节活动量巨大,极容易在创伤、肿瘤及急慢性炎症中导致关节骨软骨损伤。骨软骨损伤通常伴随关节机械应力改变,如不及时治疗会进一步导致退行性骨关节炎发生,大多软骨损伤也会发展至滑膜、关节囊及软骨下骨,导致更严重的骨软骨损伤,患肢功能障碍及生活质量下降。关节骨软骨由软骨,软骨下骨及之间的钙化层构成。关节软骨基本无血液、淋巴及神经,仅包含单一软骨细胞,细胞外基质细胞比高并且缺少局部祖细胞,导致关节软骨自身修复能力很差。关节软骨下骨主要对关节软骨起支撑作用,软骨下骨替代物的血管化不足将导致其不能及时修复,大块软骨下骨缺损将明显影响其支撑作用。骨软骨之间的钙化层包含深层透明软骨、潮线、钙化软骨、粘合线及上层软骨下骨,其结构微细并复杂,难于体外构建,但骨软骨连接区具备重要的生理功能。目前临床对软骨的修复较好方法主要是MACI技术,能达到部分透明软骨修复效果;对骨软骨损伤修复的主要方法包括自体及异体骨软骨移植,其具备软骨、软骨下骨及其间的钙化层,能取得一定临床效果。但是MACI对骨软骨损伤修复欠佳,而骨软骨移植物来源有限,但MACI及骨软骨技术提示带软骨、软骨下骨及其间的钙化层的骨软骨单元移植并结合种子细胞可能是骨软骨修复的潜在方案。理想的体外构建的组织工程替代结构应该模拟关节组织的自然结构进而恢复其正常功能,目前的骨软骨组织工程构建方法难以模拟包含骨软骨钙化层在内的骨软骨组织。由于骨及软骨脱细胞在技术上取得一定进展,通过粉碎软骨基质的方法可以将组织细胞成分去除,而保留软骨细胞外基质成分。本课题拟在此基础上,分别将含骨软骨之间钙化层的组织及软骨进行脱细胞,利用脱细胞基质材料制备含生物来源骨软骨钙化层的骨软骨支架材料,该支架包含深层透明软骨、潮线、钙化软骨层、粘合线、软骨下骨板等生理骨软骨钙化层,骨软骨上方交联多孔软骨脱细胞基质支架并体外接种骨髓来源间充质干细胞构建细胞-材料复合体,观察细胞生物学改变。本研究将为仿生制备骨软骨复合支架材料提供依据,同时为构建更为复杂的组织工程关节创造条件。本研究主要内容包括:(1)分别将软骨粉、软骨片及骨软骨复合组织脱细胞处理,鉴定脱细胞程度并检验脱细胞对骨软骨钙化层功能的影响;(2)构建含骨软骨钙化层的脱细胞骨软骨复合组织工程支架,鉴定骨软骨支架并体外检测支架生物相容性。方法:1.将天然羊软骨在蛋白酶抑制剂保护下粉碎,采用离心分选软骨微粒,经过软骨脱细胞处理后制备软骨脱细胞微粒悬液,检测其组织学,生化定量分析及理化性能检测。2.制备直径为8mm含骨软骨钙化层的骨软骨组织块,其软骨侧仅保留约100um透明软骨,经脱细胞处理后予组织学,生物化学及理化性能检测。3.采用冻干法及化学交联法制备含骨软骨钙化层的脱细胞骨软骨支架,予组织学、生物化学及理化性能检测,同时将扩增培养的羊骨髓间充质干细胞接种于含钙化层骨软骨支架两侧,体外培养7天行组织相容性和细胞毒性检测。结果:1.组织学显示直径100um以内软骨细胞微粒通过软骨脱细胞处理后无细胞碎片残留,甲苯胺蓝染色,番红O及二型胶原免疫组化染色成阳性,光镜下见软骨基质结构部分保留;生化定量结果表明DNA成分去除,保留大量细胞外基质成分;2.组织学显示含部分透明软骨的骨软骨组织块脱细胞处理后无细胞碎片残留,软骨侧甲苯胺蓝染色,番红O及二型胶原免疫组化染色成阳性,骨软骨钙化层功能基本保留;生化定量结果表明DNA成分去除,保留大量细胞外基质成分;3.含骨软骨钙化层的脱细胞骨软骨支架经组织学检测骨软骨支架连接完好,羊骨髓间充质干细胞在支架上生长良好,电镜及组织学显示细胞生长良好,有细胞外基质分泌。结论:1.直径100um内软骨组织可以通过脱细胞处理去除细胞结构并保留大量细胞外基质成分;2.仅含100um厚透明软骨的骨软骨组织通过脱细胞处理,可去除组织内细胞成分,并保留骨软骨间钙化层;3.通过冻干及化学交联可制备含骨软骨钙化层脱细胞骨软骨支架,该支架软骨侧为软骨脱细胞多孔支架,软骨下骨侧为脱细胞骨,骨软骨钙化层保留,该支架具备良好细胞相容性,无明显细胞毒性。