氨基寡糖是重要的氨基糖苷类抗生素,本研究从基因工程入手,引入生物学方法,研究氨基寡糖生物合成及其基团修饰。探索小单孢菌的甲基化基因在黑暗链霉菌中单基因异源表达的可能性、寡基因组合的可能性以及探究小单孢菌与黑暗链霉菌原生质体融合的可行性,并对黑暗链霉菌的发酵特性进行研究。具体内容如下:1.单基因genK异源组合研究:以温敏型穿梭质粒pKC1139为载体,构建genK组合到tobM2位点的重组质粒pKM103。pKM103通过接合转移导入黑暗链霉菌Tt-49,得到单交换菌株TKM201,经松弛培养,通过影印筛选与PCR鉴定,成功得到genK与黑暗链霉菌基因组合的工程菌TKM202。对TKM202的发酵产物进行MS检测,结果TKM202与TW402(AtoobM2)的代谢产物相似,主要合成安普霉素,未得到期望的甲基化新物质。2.双基因异源组合研究:与工程菌TKM202构建方法相似,以黑暗链霉菌Tt-49为出发菌株,将修饰庆大霉素C-甲基化生物合成基因genD1组合到tobM2位点,构建基因组合工程菌TDM202。经发酵提取代谢产物,经MS检测,结果还是得到安普霉素,没有获得预期的甲基化化合物。再以黑暗链霉菌TDM202为出发菌株,成功构建genX组合到tobL的基因组合工程菌TXL102。代谢产物经MS分析,发现与TDM202结果类似,主产安普霉素,没有获得新型化合物。基因组合获得成功,但没有实现功能表达。3.卡那霉素B工程菌的构建及其发酵特性研究:以主产氨甲酰卡那霉素B工程菌—黑暗链霉菌ST312为出发菌株,进一步敲除氨甲酰磷酸转移酶基因tobZ,获得直接产卡那霉素B的工程菌ST314。对工程菌ST314的生物合成潜力进行研究,在200L发酵罐上进行放大试验,测定各参数,并绘制成发酵代谢曲线图。结果表明该菌株遗传特性稳定,产抗能力得到有效恢复,提高幅度接近2倍;根据发酵代谢曲线图进行调控,该工程菌产卡那霉素B的能力上升到4500 u/mL。黑暗链霉菌ST314可以向产业化生产转移。4.科间多基因组合的探索:借助原生质体融合来探索特定的庆大霉素生物合成基因簇组合到黑暗链霉菌基因组中的可行性。利用基因工程技术,将ermE抗性基因组合到genB2位点,获得抗性标记的小单孢工程菌GEB202,其发酵产物经MS检测,结果是GEB202主要积累庆大霉素Cla,还含有少量的庆大霉素C2a和X2。对绛红色小单孢菌GEB202和黑暗链霉菌Tt-49原生质体的制备和再生条件进行考察:菌丝体制备宜用孢子悬液先接入种子培养基,再转入菌丝体培养基;在菌丝体培养基中补加甘氨酸来增强菌丝体对溶菌酶的敏感性,便于溶菌酶溶解细胞壁;溶解小单孢菌GEB202细胞壁,制备原生质体,以溶菌酶浓度8 mg/mL,35℃恒温维持6 h为宜;溶解黑暗链霉菌细胞壁,制备原生质体,以溶菌酶浓度2 mg/mL,32℃恒温维持3 h为宜。采用双抗性标记进行细胞融合考察,经多次反复探索,仍未得到定向基因整合的融合子,有待进一步探索。