【摘 要】
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植物在各种复杂环境胁迫中能调节体内新陈代谢,以维持正常的生长发育进程。microRNAs可以通过调控相关基因的表达,激活相关抗性网络信号,进而提高植物的耐受力。成熟miRNA分子可与靶基因的碱基互补位点进行结合,直接参与靶基因mRNA调控,是真核细胞基因表达的重要负调控因子。miR164介导NAC的保守调控模式,在多种植物非生物逆境应答中发挥着至关重要的调节作用,但在火龙果中尚未报道。本实验室前期
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植物在各种复杂环境胁迫中能调节体内新陈代谢,以维持正常的生长发育进程。microRNAs可以通过调控相关基因的表达,激活相关抗性网络信号,进而提高植物的耐受力。成熟miRNA分子可与靶基因的碱基互补位点进行结合,直接参与靶基因mRNA调控,是真核细胞基因表达的重要负调控因子。miR164介导NAC的保守调控模式,在多种植物非生物逆境应答中发挥着至关重要的调节作用,但在火龙果中尚未报道。本实验室前期获得了干旱胁迫下小RNA、转录组及降解组测序数据,本研究拟在此基础上,克隆hpo-MIR164及靶基因NAC,烟草瞬时共转化验证靶向切割事件,分析靶基因NAC的序列特征和亚细胞定位,解析miR164-NAC靶向关系对火龙果抗逆响应的应答模式。主要结果如下:1.hpo-MIR164前体序列的克隆及分析根据火龙果小RNA测序结果,克隆火龙果hpo-MIR164基因前体序列。hpo-MIR164前体序列386 bp,可形成典型的茎环结构,miR164/miR164*位于茎环结构的两个相反臂上,成熟序列hpo-miR164（5’-UGGAGAAGCAGGGCACGUGCA-3’）位于前体序列hpo-MIR164的5p臂上。植物miR164成熟序列比对发现,植物miR164高度保守。2.hpo-miR164靶基因的预测以火龙果RNA-Seq为数据库,利用在线软件psRNATarget,预测火龙果hpo-miR164的靶基因。预测得到c53549.graph＿c0＿ss,功能注释表明,该基因是NAC转录因子家族成员,将该基因命名为HpNAC。3.HpNAC基因的克隆及生物信息学分析克隆HpNAC基因,其包含1092 bp开放阅读框,编码363个氨基酸,属于NAM家族;hpo-miR164对靶基因的作用位点位于HpNAC ORF的638-658位碱基。4.hpo-miR164与HpNAC靶向互作验证通过修饰p Cambia35S::egfp,构建了P35S::hpo-miR164和P35S::HpNAC-egfp重组载体。利用根癌农杆菌介导的烟草瞬时共转化技术,将重组载体转入三星烟草（Nicotiana tabacum L.Xanthin）叶片中,荧光呈像仪下观察egfp报告蛋白的表达情况;在烟草叶片上观察到hpo-miR164与HpNAC的切割事件,说明hpo-miR164可通过转录后基因沉默,调节HpNAC的表达水平。5.HpNAC蛋白亚细胞定位构建植物瞬时表达载体pBWA（V）HS-HpNAC-Glosgfp,并将其导入拟南芥原生质体,结果显示目的基因定位于细胞核,说明HpNAC产物只在细胞核起作用,符合NAC转录因子的特性。6.非生物胁迫下hpo-miR164与HpNAC的表达谱利用茎环法qRT-PCR技术,对hpo-miR164和HpNAC在高盐、干旱、高温、低温、ABA等非生物胁迫下进行表达分析。结果显示,火龙果hpo-miR164在干旱、高盐、高温等胁迫下均被诱导表达;低温下,hpo-miR164表达呈现波动变化,呈先快速下降后回升的趋势;在ABA处理下,hpo-miR164表达下调。在各个处理下,HpNAC与hpo-miR164均呈现相反趋势。进一步证明hpo-miR164对HpNAC的负调控作用,miR164-NAC在火龙果响应非生物逆境中发挥了重要作用。
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