【摘 要】
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黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1,AFM1)和赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是牛奶中常见的真菌毒素,在体内不断蓄积会损害肝肾功能,严重危害人和动物的健康,且两者在人体内共存时会增加联合毒性作用的潜在风险。目前市场上的真菌毒素快速检测方法主要是操作复杂的酶联免疫吸附法和灵敏度较低的胶体金免疫层析法,且多数方法仅针对单一毒素,而多组分快速检测技术的研究也只是基于胶体金免疫层析
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黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1,AFM1)和赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是牛奶中常见的真菌毒素,在体内不断蓄积会损害肝肾功能,严重危害人和动物的健康,且两者在人体内共存时会增加联合毒性作用的潜在风险。目前市场上的真菌毒素快速检测方法主要是操作复杂的酶联免疫吸附法和灵敏度较低的胶体金免疫层析法,且多数方法仅针对单一毒素,而多组分快速检测技术的研究也只是基于胶体金免疫层析技术,难以实现真菌毒素混合污染的同步快速定量检测。因此,建立混合真菌毒素的快速检测技术对保证乳品安全和消费者健康具有重要意义和应用价值。本课题基于免疫层析原理,以AFM1和OTA为主要研究对象,将荧光微球作为示踪剂,实现了AFM1的单独检测以及AFM1-OTA的双联快速检测,提高了真菌毒素的检测效率和灵敏度,为乳品中混合真菌毒素污染同步定量检测提供了新思路,主要研究内容及结果如下:(1)基于免疫学竞争原理,构建AFM1荧光定量试纸条。在硝酸纤维素膜上分别喷涂完全抗原、羊抗鼠Ig G抗体,制备荧光探针并表征,建立AFM1时间分辨荧光免疫层析定量检测方法并应用于乳制品中AFM1的检测。在线性范围0.05 ng/m L~2 ng/m L内,AFM1的线性拟合方程为Y=-45.53Lg X+26.68(R2=0.9870),50%抑制浓度(The half maximal inhibitory concentration,IC50)为0.2041 ng/m L,检测限(Limit of detection,LOD)为0.0194 ng/m L。检测加标的牛奶样品,其回收率在83.48%~119.68%之间,相对标准偏差均低于8.11%。与近年来所报道的检测AFM1的方法相比,该方法检测限低、成本低,为快速筛选和定量分析提供了技术手段。(2)为了确保稳定可靠的定量信号输出,引入生物素-链霉亲和素(biotin-SA)独立系统,建立同时检测AFM1和OTA的双色荧光免疫层析技术,实现牛奶中混合真菌毒素的同步检测。与传统的方法不同之处,本研究将目标抗原和生物素-牛血清白蛋白(biotin-BSA)分别作为检测线和质控线,在预孵育时间为10 min、免疫层析时间为12min、双色荧光探针用量为3μL、完全抗原喷涂浓度为0.4 mg/m L等条件下,AFM1的线性拟合方程为Y=-28.47Lg X+29.81(R2=0.9845),IC50=0.2087 ng/m L,LOD=0.0527ng/m L;OTA的线性拟合方程为Y=-36.06Lg X+51.34(R2=0.9736),IC50=1.1187 ng/m L,LOD=0.1662 ng/m L。传统的双联检测回收率在42.97%~140.80%,波动范围大,稳定性差,而该方法回收率在90.16%~115.65%之间,变异系数低于7.41%。在37℃条件下可连续存储16天,即低温条件下货架期可达一年以上。应用该方法检测14份市售牛奶样品,其结果与仪器法的检测结果基本吻合。(3)为进一步提高双联试纸条的检测灵敏度和稳定性,在传统方法的基础上,建立基于二抗标记法的AFM1-OTA双联时间分辨免疫层析检测技术。通过探究抗体的标记量、样品稀释液中的甲醇浓度等参数,该方法中AFM1和OTA的检测灵敏度分别是0.0181 ng/m L和0.0363 ng/m L,比单抗标记法分别提高了5倍和3倍,不同批次的回收率介于89.65%~103.99%。在0.05 ng/m L~5 ng/m L线性范围内,AFM1的线性拟合方程为Y=-27.71Lg X+28.70(R2=0.9901),IC50=0.1696 ng/m L;在0.05 ng/m L~10 ng/m L线性范围内,OTA的线性拟合方程为Y=-25.85Lg X+39.96(R2=0.9903),IC50=0.4084 ng/m L,检测线性范围均可达到两个数量级,检测不同批次不同种类的牛奶样品,并通过国标方法进一步确证,且相关系数高于0.9789,说明该技术灵敏度高,准确可靠,在15 min内实现快速定量检测,为大批量样本的同步初筛奠定了良好基础。
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