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背景:生殖细胞是向下一代传递遗传和表观遗传信息的重要环节,生殖细胞的缺陷可导致不孕不育等疾病的发生。人类原始生殖细胞（human primordial germ cell,hPGC）特化是人类生殖和进化的基础,这一过程发生在囊胚着床后不久（约在孕2～3周）,该时期胚胎组织获取困难,不利于体外研究的开展,hPGC的特化机制目前尚无报道。尽管人类原始生殖细胞样细胞（human primordial germ cell-like cell,hPGCLC）的体外诱导系统已经建立,可以相应呈现hPGC早期发育特征,然而hPGCLC的特化机制目前仍不清晰。目的:了解人类生殖细胞的发育和调控机制,对生殖生物学和临床相关疾病的研究具有理论指导意义。本研究拟通过探讨表观遗传因子与转录谱在人类原始生殖细胞样细胞的特化过程中的相关性,以揭示其分子调控机制,为理解体内原始生殖细胞发育及特化机制提供参考。方法:我们首先利用体外诱导体系从hES细胞系中诱导获得人类原始生殖细胞样细胞（hPGCLC）,借助RNA-seq技术检测了 KDM2B在不同时间点hPGCLC中的动态表达。为了进一步探究KDM2B缺失对hESC自我更新或多能性的影响,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑工具建立KDM2B敲除（Knock out,KO）的hES细胞系;通过QPCR及蛋白印迹检测KDM2B的敲除效果,核型分析实验检测KDM2B KO hES细胞系的核型。利用QPCR、免疫荧光、小鼠皮下畸胎瘤实验等,对敲除细胞系中干性基因的表达及向三胚层分化的能力等进行检测。另外,将体外培养的KDM2B KO hESCs向hPGCLCs诱导分化,利用流式细胞分选术分选不同时间点的拟胚体中的hPGCLCs,同时利用免疫荧光验证hPGCLC的分化效率。进一步通过转录组学分析寻找KDM2B KO hPGCLCs的特异性基因表达谱,为揭示hPGCLC基因表达的分子机制提供参考。其次,利用CRISPR/Cas9技术建立KDM5B KO hES细胞系,QPCR检测其多能性基因的表达。将体外培养的KDM5B KO hESCs向hPGCLCs诱导分化,利用流式分选hPGCLCs,并用免疫荧光进一步验证分化效率。最后,利用四环素基因调控（TetOn）系统在KDM2B KO hESCs中建立Dox诱导外源性KDM2B稳定表达的hESC系。将重新表达KDM2B的hESCs向hPGCLCs诱导分化,利用流式分选hPGCLCs,并用免疫荧光进一步验证分化效率,通过回补实验验证KDM2B在hPGCLC特化中的作用。结果:我们发现,KDM2B在人类胎儿生殖细胞及体外诱导分化的hPGCLC中高表达,提示KDM2B可能在hPGCLC分化中发挥了作用。KDM2B KO hESCs与WT hESCs一样呈现紧密的圆形克隆形态,且均表达经典的多能性基因;并且,KDM2B KO hESCs与WT hESCs组一样也能形成具有三个胚层的畸胎瘤。表明KDM2B的缺失对hESC的干性维持和向三胚层分化的能力没有明显影响。将KDM2B KO hESCs与WT hESCs在4种激酶抑制剂（4i）中培养4天,并向hPGCLC诱导分化6天,发现KDM2B KO组中hPGCLC的分化效率在向hPGCLC诱导的第二天开始显著降低,KDM2B的耗竭显著损害了原始生殖细胞样细胞的分化,表明KDM2B在hESC向hPGCLC的特化过程中发挥了重要作用。转录组数据显示,在hPGCLC特化过程中,与hESCs向hPGCLCs诱导一天的细胞中高富集的生殖细胞基因不同,KDM2B敲除的hESCs向hPGCLCs诱导一天的细胞中高富集的为心脏形态发生的中胚层基因,且内胚层基因GATA5也出现上调,提示缺失KDM2B细胞在诱导为hPGCLCs第一天时已经发生体细胞分化。因此,我们推测KDM2B在hPGCLC特化的过程中可能发挥了抑制体细胞基因表达进而抑制其向体细胞方向转变的作用。值得注意的是,一些表观遗传调控因子如KDM5B、TET1在WT Day 2hPGCLCs中显著上调,而在KDM2B KO Day 2hPGCLCs中这些基因并没有转录激活,说明KDM2B的缺失影响了hPGCLC特化过程中的表观遗传学特征,而DNA甲基化失调可导致靶基因的转录异常,KDM2B的缺失导致一些表观遗传因子的改变,可能影响了 hPGCLC发育过程中细胞命运的决定。我们的数据显示,敲除KDM2B的hESC中H3K4me3的另一个去甲基化酶KDM5B的表达上调,提示可能是KDM2B缺失后的补偿效应。然而我们构建了KDM5B KO hES细胞系并将其向hPGCLCs方向分化,发现缺失KDM5B组hPGCLCs的分化效率与WT组无明显差异,说明KDM5B对于hPGCLC的特化并非不可或缺。最后,我们利用Tet-On诱导基因表达系统在KDM2B KO hESCs中建立受四环素（Doxycycline,Dox）调控稳定表达KDM2B的hES细胞系,将KDM2B的表达激活到内源性水平,发现加Dox表达KDM2B组的拟胚体中hPGCLCs的分化效率明显增高。结果说明通过外源性表达KDM2B可以修复由于缺失KDM2B引起的hPGCLC分化受损,进一步验证了 KDM2B的表达是hPGCLC特化的重要因素之一。结论:本研究发现虽然缺失KDM2B对人胚胎干细胞的干性维持和三胚层分化的潜能没有明显影响,但KDM2B的耗竭显著损害了 hPGCLCs的特化,而外源性表达KDM2B能有效地挽救这种损害,表明缺失KDM2B损害了生殖细胞特化。转录组结果表明,在hPGCLC特化过程中,KDM2B通过抑制体细胞基因的表达,进而抑制其向体细胞方向转变的作用。本研究表明,KDM2B是hPGCLC特化不可缺少的表观遗传调控因子,为研究表观遗传调控如何协调hPGC发育中的转录事件提供了一个新的角度。