目的和意义鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是一种起源于鼻咽部的高发恶性肿瘤,其发病具有显著的地域及种族特异性,大多数鼻咽癌患者分布于东南亚地区,而中国是鼻咽癌发病率及死亡率最高的国家之一。目前鼻咽癌的复发和转移是鼻咽癌临床治疗所面临的最大挑战,也是影响鼻咽癌患者生存率的主要威胁。因此针对鼻咽癌远处转移具体分子机制的深入研究是改善鼻咽癌患者预后的关键。肿瘤转移是影响肿瘤患者发病率及死亡率的重要因素,其导致的肿瘤特异性死亡约占肿瘤总死亡率的90%。肿瘤的转移是一个复杂的动态过程,其中肿瘤的血管新生作为恶性肿瘤生长和转移的形态学基础,在肿瘤远处转移的过程中起关键作用。血管生成拟态（Vasculogenicmimicry,VM）是区别于内皮细胞依赖性血管生成的一种全新的肿瘤血液供应模式。2016年,Science杂志的刊文指出VM作为传统内皮依赖性血管新生的补充,可以为肿瘤提供生长所需的血液及营养供应。VM的管道结构是由PAS染色阳性、CD31染色阴性的高侵袭性肿瘤细胞及细胞外基质重塑构成的,这种特殊结构使得肿瘤细胞更易直接与流动的血液接触,极大的增加了肿瘤细胞远处转移的风险。近年来,陆续有研究证实VM存在于乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌等多种恶性肿瘤中,且与肿瘤的转移密切相关,而VM在鼻咽癌转移中的作用及具体调控机制仍有待进一步研究。本课题组的前期研究已证实miR-124能靶向Foxq1抑制鼻咽癌的转移,但其具体分子机制尚不明确。Foxq1作为Fox家族的重要成员之一,已有研究证实它参与调控了多种肿瘤发生发展中的多种生物学过程,包括上皮间充质转化、血管新生及肿瘤的增殖和转移等。在本实验中,我们通过免疫组织化学实验检测了 1 14例鼻咽癌组织中的血管生成拟态现象,进一步分析VM与Foxq1及鼻咽癌临床资料的相关性。同时,在体外细胞实验及体内动物实验中对miR-124/Foxq1/EGFR信号轴调控VM形成和鼻咽癌转移的具体机制进行深入探讨。本研究有利于进一步阐明鼻咽癌转移的具体机制,为鼻咽癌治疗提供新的治疗靶点选择,同时为抗VM治疗应用于鼻咽癌的临床治疗提供理论支持。实验方法通过免疫组织化学实验检测了鼻咽癌组织中的血管生成拟态现象,进一步分析VM与Foxq1、EGFR及鼻咽癌临床资料的相关性;在体外细胞实验中,利用体外细胞3D培养、qRT-PCR、Western blot及细胞免疫荧光验证miR-124/Foxq1/EGFR信号轴调控VM形成;裸鼠皮下成瘤模型及裸鼠尾静脉注射肺转移模型在体内验证Foxq1通过调控EGFR促进VM形成及鼻咽癌生长转移。双荧光素酶报告基因实验和CHIP实验用于验证Foxq1直接作用于EGFR启动子区域。实验结果1.在鼻咽癌组织中,VM与Foxq1及鼻咽癌临床分期显著相关,且与鼻咽癌患者的预后不良密切相关。免疫组织化学实验检测114例鼻咽癌组织样本（Ⅰ期7例;Ⅱ期24例;Ⅲ期38例;Ⅳ期45例）及40例鼻咽炎组织样本中Foxq1的表达,统计分析发现鼻咽癌组织中的Foxq1表达较鼻咽炎组织中明显增高（p<0.001）。同时,利用PAS/CD31双重染色验证了鼻咽癌组织中VM表达,结果发现在鼻咽癌组织中存在不同程度的血管生成拟态现象,其中VM阳性的有78例（68%）,VM阴性的36例（32%）。统计结果显示VM阳性与VM阴性鼻咽癌患者中Foxq1（p<0.001）、鼻咽癌临床分期（TNM 分期）（P=0.013）、N 分期（P=0.004）具有显著统计学差异,但T分期（P=0.127）、年龄（P=0.662）及性别（P=0.577）无显著统计学差异。通过电话及门诊随访,收集1 14例鼻咽癌患者的总体生存资料,并绘制生存分析曲线,结果显示VM阳性的鼻咽癌患者的总体生存时间明显低于VM阴性鼻咽癌患者,且具有统计学意义（P=0.046）,提示VM在鼻咽癌中与患者不良预后密切相关。2.在体外细胞实验,Foxq1与鼻咽癌细胞株VM形成能力明显正相关。体外3D细胞培养实验证实不同分化程度的鼻咽癌细胞株能形成不同程度的血管样网络结构,且低分化鼻咽癌细胞株（5-8F、CNE2、C666-1）的VM形成能力明显高于高分化鼻咽癌细胞株（6-10B、CNE1）,说明鼻咽癌细胞株的VM形成能力与其恶性程度明显正相关。进一步构建稳定过表达或干扰Foxq1的5-8F、CNE1细胞株,并通过qRT-PCR及Western blot进行了验证。体外3D细胞培养结果显示干扰Foxq1的5-8F、CNE1细胞的VM形成能力明显被抑制,而过表达Foxq1能明显促进5-8F、CNE1细胞VM形成能力。以上结果说明Foxq1能促进鼻咽癌细胞株的VM形成能力。3.Foxq1能通过调控EGFR信号通路表达促进VM形成,且厄洛替尼可以阻断Foxq1诱导的VM形成。利用Oncomine,GEO,UCSC等生物信息学数据库对miR-124/Foxq1的下游靶基因进行预测,且在过表达miR-124或干扰Foxq1的鼻咽癌细胞株中进行qRT-PCR验证,结果发现诸如EGFR、TEAD1、SIX4等多个基因均有表达变化。并从中选择了 EGFR作为下游的靶基因,随后通过qRT-PCR和Western blot在干扰或过表达Foxq1的5-8F、CNE1鼻咽癌细胞中验证了 EGFR的表达。结果显示Foxq1与EGFR的表达明显正相关,过表达Foxq1能促进EGFR表达,而干扰Foxq1会下调EGFR的表达。为了进一步验证EGFR在Foxq1促VM形成过程中的作用,使用Erlotinib（EGFR抑制剂）预处理过表达Foxq1的鼻咽癌细胞24h,然后在体外3D细胞培养中检测它们的VM形成能力,发现Erlotinib处理组鼻咽癌细胞的VM形成能力被显著抑制,说明Erlotinib能阻断Foxq1对VM形成的促进作用。进一步通过免疫组化检测1 14例鼻咽癌组织样本中EGFR的表达,Pearson相关性分析结果显示Foxq1与EGFR在鼻咽癌中具有明显正相关（p<0.001,r2=0.5303）。通过分析VM阳性与VM阴性的鼻咽癌组织中EGFR的表达,我们发现VM 阳性鼻咽癌患者较VM阴性鼻咽癌患者的EGFR表达明显增高,证明EGFR与VM也有显著相关性（p<0.001）。最后,我们通过qRT-PCR、Western blot及IF检测了过表达或干扰Foxq1的5-8F、CNE1细胞中EGFR信号通路及VM相关基因的表达。结果显示过表达Foxq1的5-8F、CNE1细胞中EGFR信号通路及VM相关基因表达上调,而干扰Foxq1的5-8F、CNE1细胞中EGFR信号通路及VM相关基因表达受到抑制。以上结果均说明Foxq1在鼻咽癌细胞株中与EGFR信号通路和VM相关基因的表达明显正相关。4.Foxq1能直接结合EGFR启动子区域并调控其转录。通过UCSC和JASPAR数据库,我们发现Foxq1在EGFR启动子区域有多个预测结合位点,并通过双荧光素酶报告基因实验进行验证。结果表明,Foxq1组中EGFR转录活性较对照组有不同程度的增高,而突变m1位点（ATAGTTTAAA）或m2位点（AATTAAACATTA）后转录活性明显减弱,且同时突变m1与m2之后已无明显转录活性。说明在293T细胞中,FOXQ1通过作用EGFR号启动子,促进其转录。进一步利用染色质免疫共沉淀（CHIP）证实Foxq1在体内能直接作用于EGFR启动子区域。针对预测的结合位点m1和m2分别设计引物后,对anti-Foxq1或anti-IgG抗体共沉淀的染色质进行qRT-PCR及琼脂糖分析,发现EGFR启动子序列在anti-Foxq1组较anti-IgG组有明显的富集。综上所述,Foxq1在体内主要通过结合EGFR启动子中的m1和m2位点来促进EGFR转录。5.在体内动物实验,Foxq1能促进VM形成、鼻咽癌生长及转移。使用裸鼠皮下移植瘤模型证实Foxq1在体内与VM之间的相关性。首先,将稳定转染过表达Foxq1的5-8F细胞及对照组细胞经皮下注射至裸鼠腋下。定期测量肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。2周后安乐死裸鼠,并剥离移植瘤进行称重,结果显示过表达Foxq1组的移植瘤的生长速度及重量较对照组显著增加,且过表达组Foxq1的移植瘤呈分叶状生长,而对照组移植瘤呈圆润光滑生长。以上结果表明在体内,Foxq1能促进鼻咽癌的恶性生长。使用免疫组化分析异种移植瘤结果显示过表达Foxq1组肿瘤组织中VM的数量及Foxq1、EGFR的表达较对照组显著增加。且对移植瘤组织进行研磨提取总RNA和总蛋白后,通过qRT-PCR及Western blot分析过表达Foxq1组移植瘤中Foxq1、EGFR信号通路及VM相关基因的表达。结果显示过表达Foxq1组裸鼠的异种移植物中EGFR信号通路及VM相关基因的表达也较对照组显著增加。经裸鼠尾静脉注射过表达Foxq1的5-8F细胞及对照组细胞,构建裸鼠肺转移模型,验证Foxq1对鼻咽癌转移的影响。5周后安乐死裸鼠,并剥取肺组织进行HE染色,统计肺转移结节数量。结果显示过表达Foxq1组肺转移结节数量较对照组显著增加。综上所述,Foxq1能在体内促进VM形成、鼻咽癌生长及转移。6.在体内动物实验中,厄洛替尼及尼妥珠单抗能有有效抑制Foxq1介导的VM形成,鼻咽癌生长及转移。为了进一步在体内动物实验中验证EGFR在Foxq1介导的VM形成,鼻咽癌生长及转移中的作用。将稳定过表达Foxq1的5-8F细胞经皮下或尾静脉注射至裸鼠体内,再分别予以厄洛替尼（i.g,50mg/kg）、尼妥珠单抗（i.v,20mg/kg）或生理盐水处理。结果发现厄洛替尼组和尼妥珠单抗组的移植瘤的生长速度和体积重量明显小于对照组,且组织学分析发现厄洛替尼组和尼妥珠单抗组的移植瘤中的VM数量及肺转移结节明显减少。进一步通过qRT-PCR及Western blot实验分析移植瘤中相关基因表达,发现厄洛替尼组和尼妥珠单抗组的移植瘤中VM相关基因明显被抑制。以上结果表明厄洛替尼、尼莫妥珠单抗作为EGFR抑制剂,能够有效阻断Foxq1介导的VM形成、鼻咽癌的生长和转移。7.抗EGFR与抗VEGF药物具有协同作用,联合使用能提高抗肿瘤疗效。将过表达Foxq1的5-8F细胞经皮下注射至BALB/c裸鼠,一周后分别予以舒尼替尼、舒尼替尼+埃罗替尼、舒尼替尼+尼妥珠单抗或生理盐水处理。结果显示抗EGFR及抗VEGF药物联合应用组的异种移植瘤生长速度及体积重量明显低于舒尼替尼单药组及生理盐水对照组。通过CD31-PAS双重组织化学染色,我们发现舒尼替尼对经典内皮依赖性血管生成（EDV）有较强的抑制作用,但对VM无明显影响。而抗EGFR联合舒尼替尼对EDV和VM均有明显的抑制作用。这些结果证实了抗VEGF和抗EGFR药物具有协同作用,能同时抑制EDV及VM,为鼻咽癌的治疗提供了新的思路和选择。8.miR-124能有效抑制Foxq1介导的EGFR表达上调及VM形成。通过体外3D细胞培养进一步发现过表达miR-124的5-8F细胞的VM形成能力明显收到抑制。随后在过表达miR-124的5-8F细胞中进一步过表达Foxq1,发现Foxq1能挽回miR-124对VM的抑制作用,且这种挽回作用同样能被厄洛替尼阻断。此外,通过qRT-PCR、Western blot及IF实验发现过表达miR-124显著降低了 Foxq1、EGFR信号通路和VM相关基因的表达。结论1.VM作为鼻咽癌的独立不良预后因素,广泛存在于鼻咽癌组织中,且与Foxq1、EGFR的表达及临床分期显著相关。2.体外细胞实验证实Foxq1通过调控EGFR信号通路及VM相关基因的表达促进VM的形成。3.体内动物实验证实Foxq1在体内能促进VM形成及鼻咽癌生长转移,且这种促进作用能被厄洛替尼或尼妥珠单抗阻断。4.抗EGFR及抗VEGF药物具有协同作用,能同时抑制经典内皮依赖性血管生成及VM形成,达到更好的抑制鼻咽癌生长的效果。5.Foxq1能直接靶向结合EGFR启动子区域并促进EGFR转录。6.miR-124/Foxq1/EGFR信号轴通过调控VM形成抑制鼻咽癌生长转移。