酶法合成异麦芽/麦芽多糖及性质研究

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中国居民的日常饮食多以米面及其制品为主,其主要成分是淀粉,是机体能量摄入的主要来源,具有较高的升糖指数,长期食用会增加一些慢性疾病如糖尿病、高血压的患病风险。膳食纤维可以对机体的健康进行有效的营养干预,通过酶法改性,可以利用淀粉及其水解产物来合成膳食纤维。葡萄糖基转移酶(GTase)是一类对淀粉及其水解产物具有转葡萄糖基作用的酶,它可以将α-1,4糖苷键转化为其他糖苷键,从而可以提升淀粉的抗消化性能。本课题对来源于Lactobacillus reuteri 121的GTase进行酶学性质研究,通过分析GTase对不同淀粉/麦芽糊精的改性作用,选择出麦芽糊精(DE12)(MD)为最适作用底物,然后以MD为底物进行产物的制备,对产物制备过程进行监测并对其理化性质进行表征,最后通过体外模拟发酵对其肠道益生功能进行评价。首先,本课题对来源于L.reuteri 121的GTase基因进行异源表达获得GTase。对纯化后的GTase的酶学性质进行研究,结果表明:来源于L.reuteri 121的GTase相对分子质量为105 k Da,最适温度和最适p H分别为40℃和5.0,在p H 7.0~8.5之间保持较高的稳定性。进一步研究发现,Ca2+对来源于L.reuteri 121的GTase酶活具有明显的激活作用,1 mmol/L的Ca2+可使酶活提高约2.1倍;GTase以直链淀粉为底物进行催化反应的Km和Vmax分别为1.18 g/L和2.6×10-6 g/s。其次,以麦芽糊精(DE12)、马铃薯淀粉(PS)、玉米淀粉(MS)和蜡质马铃薯淀粉(WPS)作为底物,利用来源于L.reuteri 121的GTase进行改性。对四种改性产物的结构进行解析,结果表明:来源于L.reuteri 121的GTase具有水解作用和转苷作用且GTase更倾向作用于线性葡萄糖链。经研究,改性产物是一种异麦芽/麦芽多糖(GPMD),其中α-1,6糖苷键的存在形式有α-1,6-glc-α-1,4结构、线性α-1,6糖苷键及α-1-4,6分枝点三种。通过对比四种改性产物的结构,选择MD作为GTase的最适作用底物。随后,以MD为底物制备异麦芽/麦芽多糖(GPMD)并通过HPLC、HPSEC-MALL-RI及酶指纹图谱法等对改性过程中GPMD的结构进行分析。结果表明GTase的最小作用单元为麦芽三糖;GPMD的相对分子质量由最初的1.2×10~5g/mol降低至6.8×10~4g/mol;α-1,6糖苷键的含量由3.4%提升至41.8%;易消化淀粉(RDS)的含量由83.95%降低至57.99%,慢消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS)的含量分别由1.16%和14.89%提升至10.13%和32.53%。对GPMD的消化率进行测定,发现GPMD的消化率为79.85%,相比MD降低了约15.62%。接着对GPMD的理化性质进行表征,结果表明GPMD是一种α-多糖,其平均粒径为92.09 nm,是一种纳米级微粒。对GPMD的流变学性质进行分析,结果表明GPMD溶液是一种剪切变稀的假塑性流体。利用差示扫描量热仪和热重分析仪对GPMD的热力学特性进行分析,发现GPMD在170℃会发生强烈的热降解,相转变温度为129.05℃。对GPMD的温度及p H稳定性进行分析,结果表明GPMD在p H 4.0~9.0及4~70℃的环境可以保持稳定。最后,通过体外模拟发酵实验对GPMD的肠道益生功能性进行评价,结果表明:与低聚果糖(FOS)和菊粉相比,GPMD能够促进肠道菌群的繁殖、促进短链脂肪酸(SCFAs)的生成,为胃肠道营造一个低p H的环境。表明GPMD具有肠道益生功能,能够调节机体健康,是一种新型的水溶性膳食纤维并有望成为一种益生元。
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