柱花草(Stylosanthes guianensis)是一种产量高、营养价值高且用途广泛的优质豆科牧草,因其不耐低温的特性限制了向北推广,仅在热带和亚热带地区栽植。类受体蛋白激酶(receptor-like protein kinase,RLK)是植物中重要的蛋白激酶,它主要作为信号分子的受体发挥功能。RLKs位于细胞膜上,感知外界信号的刺激后,通过跨膜结构域将信号转导进胞内,使细胞发生磷酸化或去磷酸化的作用,进而开启或关闭下游靶蛋白。富亮氨酸重复类受体蛋白激酶(leucine-rich repeats receptor-like protein kinase,LRR-RLK)是RLKs中最大的一类亚家族。研究表明,RLKs在植物激素信号转导、生长发育以及抗逆过程中发挥重要作用,但关于柱花草类受体蛋白激酶相关的研究鲜有报道。因此本论文对柱花草富亮氨酸重复类受体蛋白激酶基因SgLRPK1的功能开展研究。柱花草富亮氨酸重复类受体蛋白激酶基因SgLRPK1完整的ORF为1800 bp,编码599个氨基酸。生物信息学分析,SgLRPK1蛋白具有N端信号肽,并且包括富亮氨酸重复序列的胞外结构域、单个跨膜结构域以及丝氨酸/苏氨酸胞内激酶结构域,属于典型的富亮氨酸重复类受体蛋白激酶。拟南芥LRR-RLKs包含15个亚家族,构建系统发育树表明,SgLRPK1蛋白与第六亚家族(LRR VI)亲缘关系最相近,自展支持率可达到99%。将长势一致的柱花草幼苗进行常温与低温处理,通过实时荧光定量PCR的方法检测SgLRPK1在低温胁迫和常温下的相对表达量。常温对照实验模拟了在一个光周期下SgLRPK1的相对表达量变化,SgLRPK1低温胁迫下的相对表达量趋势变化与之相同,均是在2 h时达到最高,随后表达量降低但均高于未处理前的表达量。并且,低温胁迫下SgLRPK1表达量提高的倍数高于常温对照组,由此得出SgLRPK1表达量上调受低温诱导,推测SgLRPK1可能参与柱花草对冷胁迫的响应过程。将SgLRPK1与绿色荧光蛋白(GFP)构成融合表达载体,与膜定位基因(OsRac3)共同转化水稻原生质体细胞,以绿色荧光蛋白(GFP)空载体转化水稻原生质体细胞作为对照。对照中整个原生质体细胞均能看到绿色荧光和红色荧光,而SgLRPK1与绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体转化的水稻原生质体细胞中,只在细胞膜上有绿色荧光的表达,与膜定位基因(OsRac3)发出红光的位置一致,因此确定SgLRPK1定位在细胞膜上。将SgLRPK1完整编码区接入pCAMBIA3301中,构建SgLRPK1过表达载体。通过农杆菌介导法将其转化柱花草,获得5株来自不同愈伤的SgLRPK1过表达柱花草植株。在SgLRPK1 ORF 5’区和蛋白激酶功能区各设计一个靶位点,构建pYLCRISPR/Cas9-DB-SgLRPK1打靶载体。通过农杆菌介导法转化柱花草,获得10株阳性打靶植株。将这10株柱花草测序后的靶点序列输入DSDecodeM网站检测,显示均未打靶成功。根据多序列比对结果,选择SgLRPK1编码区356 bp的特异性序列,装载到pCAMBIA3301-RNAi上,构建SgLRPK1干涉载体。经农杆菌介导法转化柱花草,获得3株来自不同愈伤的阳性干涉SgLRPK1柱花草植株。