【摘 要】
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目的:体外高糖培养成纤维细胞（fibroblasts,FB）,观察美宝湿润烧伤膏（moist exposed burn ointment,MEBO）对高糖培养的成纤维细胞生长的影响,通过观察MEBO对高糖培养的成纤维细胞自噬相关基因LC3、Beclin-1、p62的调控作用,探讨皮肤再生医疗技术（moist exposed burn ointment/moist exposed burn ther
【基金项目】
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基金项目:2016年国家自然科学基金项目（81660797）； 2018年广西自然科学基金项目（2018GXNSFAA281124）；
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目的:体外高糖培养成纤维细胞（fibroblasts,FB）,观察美宝湿润烧伤膏（moist exposed burn ointment,MEBO）对高糖培养的成纤维细胞生长的影响,通过观察MEBO对高糖培养的成纤维细胞自噬相关基因LC3、Beclin-1、p62的调控作用,探讨皮肤再生医疗技术（moist exposed burn ointment/moist exposed burn therapy,MEBO/MEBT）促进高糖状态慢性溃疡创面修复的机制,为临床推广提供理论依据。方法:第一部分:首先建立糖尿病大鼠创面模型,待第11天后分离、培养创面成纤维细胞,并予免疫荧光对分离的成纤维细胞进行鉴定,再配置含有MEBO的高糖培养液,并摸索最适生长浓度,细胞经消化、传代至第3代后,随机将细胞分成两组:对照组、MEBO组,（1）采用CCK-8法检测第12小时、24小时、48小时、72小时、96小时细胞增殖情况;（2）采用细胞划痕试验来观察MEBO对成纤维细胞迁移的影响。第二部分:以上成纤维细胞经消化、传代至第3代后,取对数期（第3天）的细胞分为以下7组:空白组、模型组、MEBO低浓度组、MEBO中浓度组、MEBO高浓度组、雷帕霉素+MEBO组、雷帕霉素组（除了空白组用低糖培养基,其余组均用高糖培养基）。分别予:（1）免疫荧光检测LC3、Beclin-1、p62染色;（2）透射电镜检测细胞自噬体;（3）q RT-PCR检测LC3、Beclin-1、p62的m RNA表达;（4）蛋白免疫印迹（Western blotting,WB）法检测LC3、Beclin-1、p62的蛋白表达。结果:第一部分:（1）细胞增殖试验:第48小时起MEBO组各个时间点的光密度（optical density,OD）值均高于对照组（P<0.05）,细胞增殖率在第72小时最高;（2）划痕实验检测示:MEBO组促进成纤维细胞迁移能力比对照组强,差异有统计学意义（P<0.05）。第二部分:（1）免疫荧光检测示:与空白组相比,各组中LC3、Beclin-1的荧光染色OD值最高为MEBO高浓度组,最低为空白组,MEBO低、中、高浓度组的OD值逐渐升高,Beclin-1中的雷帕霉素+MEBO组的OD组高于雷帕霉素组;各组中p62荧光染色OD值最高为空白组,最低为MEBO高浓度组,MEBO低、中、高浓度组的OD值逐渐降低,雷帕霉素组的OD值高于雷帕霉素+MEBO组;（2）电镜检测示:与空白组相比,MEBO高浓度组、雷帕霉素组与雷帕霉素+MEBO组的自噬小体数量较多,且结构较为典型,MEBO低、中、高浓度组的自噬小体数量逐渐增多;（3）q RT-PCR显示:与空白组相比,各组中LC3的雷帕霉素+MEBO组与Beclin-1的MEBO高浓度组相对表达量最高,且MEBO组中有浓度升高表达量增大的趋势,LC3的雷帕霉素+MEBO组表达量明显高于雷帕霉素组;p62的雷帕霉素组相对表达量最低,MEBO组内比较有浓度升高表达量降低的趋势;（4）蛋白免疫印迹测定蛋白示:LC3、Beclin-1两者中的雷帕霉素+MEBO与MEBO高浓度组蛋白表达量均明显高各组,MEBO组中各因子表达随浓度升高,加入MEBO后雷帕霉素组的表达量均增高,而p62的蛋白表达情况相反。结论:MEBO可致高糖培养的成纤维细胞自噬相关基因LC3、Beclin-1表达量增高,p62表达降低,调控细胞自噬,促进成纤维细胞增殖,这可能是MEBT/MEBO促糖尿病慢性创面修复的机制之一。
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