背景:当前社会老龄化问题日益严重,有关老年男性雄激素缺乏的问题逐渐成为引人注目的焦点,男性迟发性性腺功能减退症（late-onset hypogonadism,LOH）是指中老年男性随年龄增大,血清睾酮水平进行性下降而出现的一组临床综合征。睾酮分泌减少是LOH极为重要的特征之一,同时也是LOH诊断的必要条件。最近的研究表明,存在与下丘脑-垂体-性腺轴平行的内分泌通路,该通路能够作用于睾丸的内分泌功能,其中涉及骨源性激素骨钙素。骨钙素（osteocalcin,OC）是成骨细胞分化成熟后特异表达的标志蛋白,被视为骨更新和骨转化的标志物。骨钙素在人体内有羧化完全的骨钙素（c OC）有和未羧化的骨钙素（uc OC）两种表达形式。完全羧化的骨钙素在骨代谢中起到重要作用,能够帮助其于与羟基磷灰石的结合,保持骨骼的正常矿化。另一部未羧化的骨钙素被释放在血液中,具有生物学活性。研究证明,未羧化的骨钙素与男性生殖密切相关,骨骼可以通过未羧化骨钙素调节睾丸间质细胞的功能,并通过睾酮水平的变化影响睾丸的生精功能,然而骨钙素对衰老引起的睾酮水平下降的作用未知。本研究将通过D-半乳糖溶液皮下注射构建雄性大鼠的衰老模型,研究未羧化骨钙素对老年雄性大鼠睾酮合成功能的影响,希望为临床上利用骨钙素治疗男性迟发性性腺功能减退症提供研究基础。目的:建立衰老大鼠模型,探究未羧化骨钙素对老年雄性大鼠睾丸间质细胞睾酮合成的影响。方法:1、随机将3月龄的雄性SD大鼠分为两个组,其中一组采用颈背部皮下注射10%浓度的D-半乳糖溶液300mg·kg^-1·d^-1方式持续注射8周制造亚急性大鼠衰老模型,另一组采用相同方式注射同等剂量的生理盐水持续注射8周作为对照组进行对照。8周后采用脱颈法处死大鼠,分别称量大鼠体重和睾丸重量,计算睾丸脏器指数;取眼眶静脉血行睾酮激素检测,用甲醛溶液固定睾丸组织后进行HE切片染色观察;取大鼠睾丸组织检测其氧化应激指标SOD活力和MDA含量,根据检测结果判定大鼠衰老模型是否成功的建立。2、取大鼠睾丸组织,剪碎后利用Ⅳ型胶原酶消化后使用percoll溶液梯度密度离心法分离、纯化原代睾丸间质细胞,并采用3β-HSD染色方法对睾丸间质细胞进行鉴定。3、分别用不同质量浓度0（等量PBS溶液）、1、3 ng/m L的非羧化骨钙素刺激大鼠睾丸间质细胞,24小时后收取培养液采用睾酮ELISA检测试剂盒进行睾酮浓度检测;采用荧光定量PCR法检测睾丸间质细胞St AR、Cyp11a、Cyp17等睾酮合成关键酶的表达。结果:1、亚急性大鼠衰老模型的鉴定:在注射D-半乳糖溶液4周后大鼠逐渐出现嗜睡,活动减少,毛发卷曲丧失光泽甚至部分脱落等现象。在8周后,发现模型组大鼠饮食明显减少,身型萎缩,行动迟缓,反应变慢。相比于正常对照组,模型组大鼠血清睾酮水平降低（P<0.05）,睾丸指数下降（P<0.05）。血清氧化应激指标的测定显示,与正常对照组相比,模型组SOD酶活力下降（P<0.05）,MDA含量增加（P<0.05）。HE染色显示对照组大鼠睾丸组织的结构完整,生精小管饱满,生精细胞数量相对较多且排列整齐,管内精子含量相对较高,间质细胞数量相对较多。模型组大鼠睾丸组织的结构混乱,生精小管上皮损伤、萎缩,生精细胞数量相对较少且排列无规律;管内精子数目减少,间质细胞少见。2、睾丸间质细胞的培养和鉴定:提取后的原代睾丸间质细胞在培养基中培育12小时候,绝大多数细胞开始贴壁生长,此时睾丸间质细胞成团分布,大多呈现为圆形或者纺锤形,48小时后睾丸间质细胞将会从胞体内生出触角。对培养了48小时的睾丸间质细胞进行3β-HSD染色,阳性细胞胞质内存在大量蓝色物质。3、未羧化骨钙素对衰老大鼠睾丸间质细胞睾酮水平的影响:同加入等量PBS溶液的对照组大鼠睾丸间质细胞相比,加入等量PBS溶液的模型组大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮水平下降（P<0.05）;对模型组大鼠睾丸间质细胞分别进行1、3 ng/m L未梭化骨钙素处理,相较于模型组加入等量PBS溶液处理的睾丸间质细胞,骨钙素处理组细胞培养液上清中睾酮水平均升高（P<0.05）,但仍低于对照组大鼠睾丸间质细胞睾酮水平（P<0.05）。以上结果表明,衰老模型组睾丸间质细胞睾酮合成能力较对照组下降明显,经uc OC处理后可明显提高其睾酮合成能力。4、未羧化骨钙素对衰老大鼠睾丸间质细胞睾酮合成关键酶的影响:实验结果显示,与加入等量PBS溶液的模型组大鼠睾丸间质细胞相比,经过1 ng/ml未羧化骨钙素处理后的模型组大鼠睾丸间质细胞的St AR、Cyp11a、Cyp17基因的表达有明显的上升;经过3 ng/ml未羧化骨钙素处理后的模型组大鼠睾丸间质细胞的St AR、Cyp11a、Cyp17基因的表达有显著上升;说明外源性加入的未羧化骨钙素可以促使模型组衰老大鼠睾丸间质细胞睾酮合成关键酶表达上升,并且在一定程度上可能和剂量浓度具有相关性。结论:本研究成功的构建了D-半乳糖诱导的衰老大鼠模型,证明了未羧化的骨钙素可以促进D-半乳糖诱导的老年大鼠睾丸间质细胞睾酮合成,并且该作用可能是由于未羧化骨钙素促进其睾酮合成关键酶的表达引起的。