虹鳟(Oncorhynchus mykiss),是隶属于鲑形目(Salmoniformes)、鲑科(Salmonidae)、大麻哈鱼属(Oncorhychus)的一种典型的冷水性养殖鱼类。虹鳟性成熟时,能量多用于满足性腺发育和维持第二性征以及生殖行为,导致二倍体虹鳟肉质和外观品质下降。三倍体雌性虹鳟的卵母细胞发育受到完全抑制,性腺发育异常恰消除了由性成熟引起的不良结果。然而目前三倍体雌性虹鳟性腺败育的深层机理方面的研究并不详尽。在本实验室前期工作的基础上,本研究继续就三倍体虹鳟卵母细胞发育阻滞进行分子调控机制探究。由于三倍体雌性虹鳟有三套染色体,在减数分裂偶线期,即同源染色体联会发生紊乱,使得减数分裂不能正常进行,无法排出成熟配子,导致不具备受精能力。Spindlin(Spin)基因在前期的研究中被证明是减数分裂纺锤体相关的母体效应因子,且从卵母细胞到早期胚胎发育的过渡期间,在细胞周期调节中发挥作用。而β-Tubulin属于细胞骨架结构物质,在性腺发育中,有保持卵细胞形态、协调细胞内物质交换以及辅助细胞增殖等功能。两种基因在性成熟阶段皆发挥重要作用。因此,本研究以减数分裂相关调控机制为切入点,选取二、三倍体雌性虹鳟240-330 dpf(days post fertilization,dpf)发育时期,对Spindlin与β-Tubulin基因进行克隆,采用实时荧光定量(RT-PCR)、组织切片、蛋白质印迹法和免疫组织化学方法鉴定了二、三倍体雌性虹鳟卵母细胞不同发育阶段减数分裂进程中的表达差异情况及不同时期两种蛋白的亚细胞定位情况,从而探明三倍体雌性虹鳟在性细胞增殖分化异常的调控关键。具体研究结果如下:1、通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术,获得Spindlin基因cDNA 4,529 bp(Gen Bank登录号:MN378564),命名为Os Spindlin。其中3’非编码区(UTR)和5’非编码区(UTR)分别长3,662 bp、141 bp,开放阅读框(ORF)长726 bp,编码241个氨基酸,该蛋白质序列的相对分子量为28.3 KD,理论等电点值为5.94,无跨膜结构。同源性分析表明,虹鳟(Oncorhynchus mykiss)与银大马哈鱼(Oncorhynchus kisutch)同源最高,高达99.59%。系统发育进化树显示,虹鳟与大鳞大马哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)和红点鲑(Salvelinus alpinus),聚为一支。Os Spindlin基因在二倍体与三倍体雌性虹鳟在胚胎发育各时期均有少量表达,呈现下降的趋势,其中在受精卵时期表达量最高。同一发育时期,二倍体虹鳟的Os Spindlin基因相对表达量都高于三倍体虹鳟,二倍体与三倍体虹鳟的受精卵时期、8细胞期和尾芽期之间有显著性差异(P<0.05),然而其他时期并未有显著性差异(P>0.05)。Os Spindlin基因在虹鳟成鱼卵巢、肾、肝、脾、肌、鳃、心、眼、肠、鳍组织中均有表达,其中,在卵巢中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01)。对于雌性虹鳟二倍体,在受精后240-300 dpf发育阶段,Os Spindlin基因在卵巢组织中的相对表达量显著下降。对于雌性虹鳟三倍体,该基因在240-330 dpf阶段的表达量显著上升。同一发育阶段中,Os Spindlin基因在雌性虹鳟二倍体卵巢中的表达量较雌性虹鳟三倍体相对较高,且均存在极显著差异(P<0.01)。Western blot结果显示Spin蛋白在240-330 dpf发育阶段均有表达,对于二倍体雌性虹鳟,Spin蛋白在240 dpf表达量最高,在270 dfp降低,270-330 dpf呈现上升趋势,与二倍体虹鳟相比,三倍体虹鳟有相同的变化趋势,在相同时期,二倍体与三倍体虹鳟Spin蛋白的表达量之间有显著性差异(P<0.05)。免疫组化结果发现,雌性虹鳟二倍体在240 dpf阶段,Spin蛋白在初级卵母细胞核内信号最强,在270-330 dpf阶段逐渐减弱;三倍体虹鳟卵巢在240-330 dpf发育阶段,在卵原细胞中信号逐渐增强。上述研究表明,三倍体雌性虹鳟在减数分裂过程中出现异常与Os Spindlin基因的低表达有关。2、通过克隆得到虹鳟β-tubulin基因开放阅读框1,533 bp,获得Gen Bank登录号:MN931398,编码424个氨基酸。通过对其编码的蛋白质进行分析,虹鳟β-Tubulin蛋白质的相对分子量为47.5KD,理论等电点值为4.73,不稳定指数为38.85,此蛋白为不稳定蛋白。该基因无信号肽,无跨膜螺旋区。β-Tubulin氨基酸同源性比对,在硬骨鱼类中,虹鳟与银大马哈鱼(Oncorhynchus kisutch)同源最高,为94.37%。系统进化树结果显示:虹鳟β-Tubulin氨基酸序列与其他鲑科鱼类比对单独为一支,与大西洋鲑(salmo salar)与大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)的亲缘关系最近,其次为硬骨鱼类与哺乳类基本分为两支,其中与鸡的亲缘关系最远,其他鱼类亲缘关系介于两者之间。β-tubulin基因在二、三倍体雌性虹鳟在胚胎发育时期的相对表达量结果显示,总体趋势是先上升后下降,在2细胞期表达量最高,是受精卵、8细胞期、16细胞期和桑葚期的28.4、7.2、7.9和9.5倍,与二倍体虹鳟相比,三倍体虹鳟在受精卵到2细胞期有相同的上升趋势且有显著性差异(P<0.05)。同一发育时期,β-tubulin基因在二倍体虹鳟的表达量均高于三倍体虹鳟。β-tubulin基因在成鱼二倍体雌性虹鳟的鳍、肾、肝、脾、肌、鳃、心、眼、肠、卵巢等10个组织中均有表达。在卵巢组织的表达量极显著高于其它各组织(P<0.01)。通过分析β-tubulin基因在二三倍体雌性虹鳟成鱼卵巢组织中不同发育阶段的相对表达量,在240-330dpf发育阶段,表达量呈现先上升后下降的趋势,270 dpf表达量最高,是240 dpf、300 dpf和330 dpf的1.2、2.2和2.8倍。270 dpf与240 dpf表达量有显著性差异(P<0.05),与后期表达量之间差异并不显著(P>0.05)。三倍体虹鳟在240-330 dpf发育阶段,总体趋势与二倍体虹鳟卵巢相对表达量相同,在240-270 dpf阶段,β-tubulin基因的相对表达量显著的上升,在270 dpf表达量最高,且240 dpf与270dpf存在极显著差异(P<0.01),然而270-330 dpf之间差异不显著(P>0.05)。总体而言,β-tubulin基因在同一发育阶段中,二倍体虹鳟较三倍体虹鳟表达量相对较高。微管蛋白β-Tubulin在卵巢组织中的表达和定位分析,β-Tubulin蛋白与Spin蛋白在各时期性腺表达趋势不同,在240-330 dfp发育阶段,β-Tubulin蛋白有先升高后降低的表达趋势,在270 dpf发育阶段表达量达到最高,然而二三倍体无显著性差异(P>0.05)。在其他各时期,二、三倍体虹鳟之间均有显著性差异(P<0.05)。在卵巢组织蛋白定位结果显示,对于二倍体雌性虹鳟卵巢,在240-330 dpf,阳性信号主要集中在细胞质,且信号呈现先增强后减弱的趋势。这与Spin蛋白的动态变化有所不同。与二倍体雌性虹鳟相比,三倍体虹鳟卵巢在240-330 dpf阶段,信号多集中在卵原细胞簇间隙的滤泡细胞和支持细胞中,卵原细胞上信号较弱。结果表明,三倍体虹鳟卵细胞在增殖分化过程中表现出的异常,与微管β-tubulin基因低表达及亚细胞定位有关。通过本实验结果可得出,在三倍体雌性虹鳟性腺在发育过程中卵母细胞成熟受阻,可能与Os Spindlin和β-tubulin基因的低表达量和Spin和β-Tubulin蛋白在二倍体与三倍体雌性虹鳟卵巢中动态分布差异有关,这对进一步揭示三倍体性腺败育提供有力证据。