孕激素是脊椎动物的主要性类固醇激素之一,参与生殖过程的调控。在绝大多数雌性硬骨鱼类中,孕激素主要为17α,20β-双羟孕酮（DHP）,由卵泡的滤泡层分泌,是诱导鱼类卵母细胞成熟的类固醇激素。有研究报道DHP介导了由LH所诱发的排卵过程,但目前对于其具体的机理和分子机制尚不清楚,还需深入研究。孕激素需要通过与其受体结合来发挥作用。经典的孕激素核受体（nPR/Pgr）能与DHP结合,作为转录因子或者辅助调节因子调控下游靶基因的表达。对哺乳类的研究表明,在排卵过程中,PGR的参与是必不可少的;然而,目前对于PGR调控排卵的机制还未完全阐明。本研究以模式动物斑马鱼（Daniorerio）为研究对象,通过TALENs、组织化学切片、RNA-seq、卵泡离体培养、荧光定量PCR和Western blot等技术,首次对DHP及其核受体Pgr参与调控鱼类排卵的分子机制进行了系统的研究。主要研究成果如下:1.采用TALENs技术,构建并筛选出了 3个具有不同移码突变序列的Pgr敲除（pgr-/-）斑马鱼家系。应用特异性抗体未能在pgr-/-雌性斑马鱼卵泡中检测到Pgr蛋白表达。该突变家系的雄鱼具备正常的生殖能力,但雌鱼出现不育的表型。进一步的组织学分析观察到雌鱼不育的原因为成熟卵子无法完成排卵。该研究,首次从基因敲除水平阐明Pgr是鱼类排卵过程的重要调控因子。2.在产卵前1小时,收集自然成熟但还未发生排卵的卵泡,应用RNA-seq技术比较野生型（wt）和pgr-/-滤泡层转录表达差异。结果显示,总共3567个基因的表达在wt和pgr-/-间存在显著性差异（fold change≥2,P ≤ 0.05）,其中1543个基因在wt中表达高于pgr-/-,2024个基因在wt中表达低于pgr-/-。主成分分析显示三个pgr-/-样品聚为一簇,在PC1轴上和三个wt样品分离;对显著性排名前2000个基因进行热图分析,结果表明大多数在wt中高表达的基因在pgr/-中受到抑制。富集分析显示在wt中相对高表达的基因富集于炎症反应、血管生成、细胞因子、趋化因子、细胞迁移和细胞骨架重组等一系列对排卵至关重要的信号通路和生物学过程;而在pgr-/-中相对高表达的基因则涉及DNA复制、修复、甲基化、端粒维持、细胞生长和增殖等过程。这些结果表明排卵前受Pgr调控的滤泡层组织的命运转变对于排卵的发生极其重要。3.基于转录组分析结果,筛选出可能受Pgr调控的6个金属蛋白酶基因,即解聚蛋白样金属蛋白酶8b（ada8b）、含I型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶1（adamts1）、adamts8a、adamts9 基质金属蛋白酶2（mmp2）和mmp9,应用实时荧光定量PCR技术（qPCR）分析这些基因在卵泡发生过程中的表达模式。结果显示,adam8b、adamts1、adamts8a、mmp2和mmp9虽在各期卵泡中都有表达,但在成熟前后的卵泡间无显著变化;相比之下,adamts9的表达在成熟前的各时期卵泡（I-IVa期）中均维持在极低水平,但在成熟后卵泡（IVb期）中,其表达量急剧上升;adamts9的这一表达模式在wt和pgr-/-中均有出现,但wt的增幅比例是pgr-/-的10倍以上。针对IV期卵泡,在一天内不同时间点分别收集其滤泡层和卵母细胞,检测6个金属蛋白酶基因的表达变化。结果显示,卵母细胞中adam8b、adamts1、mmp2和mmp9的表达稳定,而adamts8a和adamts9的表达量极低甚至无法检测;滤泡层中adam8b、adamts1、adamts9和mmp9的表达卵泡成熟后（IVb期）迅速上升,其中adam8b、adamts9和mmp9的表达在pgr-/-中显著低于wt;而pgr基因的转录本和蛋白出现在卵泡自然成熟前1～2小时（IVa期）瞬时升高,随后在IVb期下调的现象。这些结果表明,在Ⅳ期卵泡成熟过程中,Pgr先于adam8b、adamts1、adamts9和mmp9出现瞬时表达升高的现象,提示这些基因属于Pgr调控排卵的靶基因,可能参与卵泡破裂。仅adamts9呈现滤泡层特异表达,且在卵泡成熟后迅速上升的模式,提示其可能在排卵中具有特殊作用。4.考虑到adamts9在卵泡发生中表达模式的特殊性（IVb期上升）,以及其特异表达于滤泡层的特性,进一步用卵泡离体培养实验探究了 adamts9表达和DHP及Pgr的关系。结果显示,DHP处理2小时,就能诱导wt卵泡成熟,且以一种剂量和时间依存的方式诱导wt卵泡中adamts9的表达;DHP（100nM）处理能诱导pgr-/-卵泡成熟,但却不能诱导adamts9的表达;Western blot结果显示,与体内自然成熟的卵泡一样,体外DHP处理诱发卵泡成熟后,Pgr蛋白水平显著减少;高浓度RU486（10μM）和睾酮（T,500nM）虽均能诱导卵泡成熟,但对adamts9的表达,以及Pgr蛋白水平均无影响。这些结果说明,DHP在诱导卵泡成熟的过程中,通过Pgr诱导adamts9表达。然而,DHP作用下adamts9的表达水平远低于体内自然成熟的卵泡,提示其他内分泌因子也参与了 acdamtt9表达的调控。人绒毛膜促性腺激素（hCG）可通过Lh受体（Lhcgr）诱发鱼类卵泡的成熟和排卵。体内实验结果显示,lhcgr在卵泡成熟后（IVb期）瞬时升高,这与adamts9的表达模式相似。体外实验虽然观察到hCG也可诱导wt卵泡成熟,但诱导效应远低于DHP,且对adamts9的表达没有影响。有趣的是,DHP（100 nM）和hCG（10或50IU/mL）共处理能显著上调wt和pgr7-卵泡中adamts9的表达水平,且呈现hCG剂量依存效应,同时上调幅度显著高于DHP单独处理。用RU486（10μM）和hCG（50IU/mL）共处理wt和pgr/-卵泡,发现伴随着卵泡的成熟,adamts9的表达显著上升,与DHP和hCG共处理的结果相似;用T（500 nM）和hCG共处理卵泡也观察到相似的现象,表明卵母细胞成熟可能是hCG直接诱导adamts9表达的先决条件。上述结果提示,在卵泡成熟前（IVa期）,DHP可通过Pgr启动adamts9的表达,当卵泡成熟后（IVb期）,Lh信号通路进一步增强了adamts 的表达水平。综上所述,本研究通过构建斑马鱼Pgr敲除家系,首次阐明Pgr是鱼类排卵过程必需的重要调控因子。应用这一家系,结合RNA-seq技术,表明排卵前Pgr调控滤泡细胞发生命运转变对于排卵极其重要。基于转录组分析结果,进一步分析金属蛋白酶基因在排卵前的表达特征,其中adamts9呈现滤泡层特异表达,且在卵泡成熟后迅速上升的模式。体外实验提示,在卵泡成熟前（IVa期）,DHP可通过Pgr启动adaamt9的表达,当卵泡成熟后（IVb期）,Lh-Lhcgr信号通路协同DHP-Pgr信号通路,进一步增强了a amts9的表达水平。DHP和Lh协同调控adamts9的表达,可能是为了使其表达水平达到排卵所需,促进排卵的发生。