精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是精子发生的干细胞,是成年动物体内具备自我更新和多向分化潜能的二倍体永生细胞群。十几年来,SSCs移植技术的发展为SSCs的相关研究提供了极大便利,使SSCs的研究更加深入。为了给小鼠SSCs的体外分化、转基因、移植等体外操作提供理论依据和技术方法,本研究主要进行了小鼠精原细胞(含SSCs)的体外培养特性及冷冻保存研究。结果如下:1、为研究小鼠精原细胞的体外存活、增殖特性,优化其体外培养体系,本实验利用7日龄昆白系小鼠睾丸,一步酶法分离获得生精上皮单细胞悬液(主要含精原细胞和支持细胞),分别接种于D-MEM、D-MEM/F12和KSOM后系统研究了精原细胞的存活和增殖情况。结果显示,小鼠精原细胞在D-MEM和D-MEM/F12中均能存活并增殖,表现为在培养的第1~9天/1~8天呈逐渐减少趋势,第9~13天/8~12天呈增殖趋势,第17天/16天以后增殖减缓,而小鼠精原细胞在KSOM中只短暂存活不能增殖。2、为摸索小鼠精原细胞单细胞形式以及功能性结构形式(曲细精管和完整睾丸)冷冻保存方法,本实验以10% DMSO为冷冻保护剂,对生精上皮单细胞、曲细精管及完整睾丸进行了-70℃冷冻保存,同时对生精上皮单细胞进行了液氮冷冻保存,并对冻存后细胞进行了培养。结果显示,完整睾丸、曲细精管及生精上皮单细胞经1周冻存复苏后细胞存活率分别为85.75±2.24%、93.28±0.37%和90.21±0.89%,曲细精管经2周冻存复苏后细胞存活率为91.27±0.39%,生精上皮单细胞经2周、1个月和3个月液氮冻存复苏后细胞存活率分别为91.17±1.47%、90.51±1.34和89.73±2.51%。复苏后精原细胞培养第10天出现旺盛增殖行为。3、为探索小鼠精原细胞的纯化方法,验证小鼠精原细胞无饲养层培养的可行性。本实验用机械震摇法对处于旺盛增殖期的精原细胞集落进行了纯化,并分别接种于未包被培养板及明胶包被培养板后进行培养,详细观察了精原细胞的培养特性。结果显示,该纯化方法效果较为理想,纯化的精原细胞在无饲养层培养(包被或不包被培养板)条件下能够存活20~25天,但未观察到明显的增殖现象,集落中精原细胞形态(由外周到中心)由圆形或微卵圆形逐渐演化为带尾的精子样细胞,表现出分化迹象。