日本脑炎(Japanese encephalitis),又称流行性乙型脑炎,简称乙脑,是由日本脑炎病毒(Japanses encephalitis virus, JEV)引起的一种人畜共患性传染病。JEV主要的传播媒介是库蚊,对多宿主具有致病作用,人是其终末宿主。JEV不仅引起严重的公共卫生问题,且可引起其扩大宿主猪的繁殖障碍,对畜牧业造成很大损失。中国是乙脑高发的国家。近年来,我国的畜牧业,特别是养猪业高速发展,增加了乙脑监测的难度和发生的风险。本试验从猪流产胎儿脑组织样中分离到两株乙脑病毒,对其生物学特性进行系统的研究；克隆了二者编码区序列,与GenBank中其他毒株比较,进行了分子生物学的分析,为乙脑在中国特别是四川省的预防和控制提供分子流行病学依据,丰富了乙脑研究的素材。1两株猪源日本脑炎病毒的分离鉴定采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)对从四川各地采集蚊样及猪流产死胎样本进行JEV的病原检测,检测阳性的样品脑内接种5日龄乳鼠,2批采自大兴的流产胎儿样品均在接种第3代后4天明显表现出沉郁、拒乳、抽搐并消瘦,第5天衰竭麻痹,最终致死。发病乳鼠的脑组织取出,研磨离心处理后接种BHK-21细胞,在第4天细胞开始出现变圆、回缩并从细胞层脱落的细胞病变现象。细胞上连续传代时细胞病变稳定出现,到第15代后细胞病变趋于提前,在第4天CPE近90%。本研究对两株病毒的生物学特性和理化性质进行了分析,并采用琼扩试验、间接免疫荧光检测、RT-PCR以及中和试验对所分离的两株病毒进行鉴定,结果显示：两株病毒均为RNA病毒,对乙醚和氯仿敏感,在pH3.0条件下病毒失去感染活性,对胰蛋白酶敏感,60℃加热60min、100℃加热2min均可使其灭活。RT-PCR反应可以扩增出JEV prM-C保守区段的特异性片段,琼扩试验和间接免疫荧光检测均呈阳性反应,均可被阳性血清中和。确认分离到两株JEV,并命名为SCYA201201、SCYA201202。2编码区序列克隆分析设计8对引物,将JEV基因组分为8段进行PCR扩增,将扩增片段克隆后测序,测序结果显示：SCYA201201株、SCYA201202株的开放阅读框10296 nt,编码3432个氨基酸,二者之间单核苷酸和氨基酸相似度99.9%,两株病毒之间在C/prM区段有2个氨基酸的差异,E蛋白有1个氨基酸差异,共3个氨基酸不同。以登革病毒为外群,选取国内外具有代表性的JEV基因序列进行E基因和prM基因的系统发育进化树分析,两株病毒均为基因Ⅰ型JEV。与来自不同国家和地区、不同宿主的Ⅰ型和Ⅲ型JEV毒株编码区序列进行相似性比对,结果表明：SCYA201201株与其中的1型JEV的核苷酸相似度≥97.7%,与Ⅰ型JEV的氨基酸相似度≥98.3%; SCYA201202株与其中的1型JEV的核苷酸相似度≥97.8%,与1型JEV的氨基酸相似度≥98.4%。2分离株高度同源,所有蛋白中只有3个氨基酸的差异,关键位点E 138位均为谷氨酸Glu(E), E176位均为异亮氨酸He (I), E279位均为赖氨酸Lys (K),两分离株具有噬神经性强毒分子特征。3 JEV分离株生物学特性的初步研究蔗糖-丙酮抽提法提取SCYA201201、SCYA201202株血凝素对其血凝条件进行了研究,结果显示在pH6.4反应环境中可稳定凝集鸽红细胞。利用荧光定量RT-PCR方法,对SCYA201201在心、脑、脾、胸腺、肾、肝组织中的增殖情况进行了初步研究,分析结果显示SCYA201201株可在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胸腺外周组织和脑组织中增殖,具有噬神经的特点。