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肠易激综合征(Irritable Bowel Syndrome,IBS)是一种临床上常见的肠道功能紊乱性疾病,以腹部不适、腹痛为主要表现,并伴有排便习惯和性状的改变。IBS的发病机制可能涉及到基因多态性、肠粘膜屏障、胃肠功能异常、内脏高敏性、精神心理因素、脑肠肽分泌紊乱及免疫功能失调等多个方面。其中胃肠功能异常和内脏敏感性是IBS的主要病理生理学特征,是产生腹痛、腹泻、便秘等IBS临床症状的重要基础。蜘蛛香(Valerianajatamansi Jones)常用于治疗消化不良、腹胀、腹痛及腹泻等胃肠系统疾病,且疗效显著。现代药理学研究表明,蜘蛛香具有抑制胃肠运动亢进、镇静、镇痛以及抗惊厥等作用。本组前期研究发现,蜘蛛香原粉以及蜘蛛香环烯醚萜对慢性应激所致IBS模型大鼠的5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、胃肠激素以及结肠肥大细胞(mast cell,MC)均具有一定的调节作用,可以有效改善IBS模型大鼠的肠道功能紊乱及精神活动的异常。蜘蛛香环烯醚萜类成分ZXX、ZXY是从生药蜘蛛香中提取分离得到的两种单体,其结构稳定且生物活性高,具有很高的研究价值。本课题组前期研究表明,ZXX、ZXY能缓解利血平所致的小鼠腹泻以及醋酸所致的小鼠腹痛,提示ZXX、ZXY具有抑制肠道动力以及镇痛的作用。ZXX、ZXY对IBS是否具有治疗作用,目前尚未见报道。基于以上认识,本研究通过观察ZXX、ZXY对慢性应激所致IBS模型大鼠内脏敏感性、排便、精神活动、摄食量以及形态学的影响,评价其对IBS的治疗作用;并通过观察其对外周5-HT通路、结肠胃肠激素以及结肠MC的影响,探讨其治疗IBS的部分外周作用机制。1 ZXX、ZXY对慢性应激所致IBS模型大鼠的药效学研究目的:观察ZXX、ZXY对IBS模型大鼠内脏敏感性、排便、精神活动、摄食量以及形态学的影响。方法:将SD雄性大鼠随机分为:对照组、IBS模型组、匹维溴铵组(25 mg/kg)、氟西汀组(2.5 mg/kg)、ZXX 大、中、小剂量组(1.2mg/kg、0.6mg/kg、0.3 mg/kg)、ZXY大、中、小剂量组(0.6mg/kg、0.3 mg/kg、0.15 mg/kg)。采用多种慢性应激相结合的方法建立IBS大鼠模型。受试药组和阳性药组动物造模同时每日灌胃给药。观察ZXX、ZXY对IBS模型大鼠腹部回撤反射压力阈值、2h内的排便粒数、排便含水量、敞箱行为评分、敞箱排便粒数、24h内摄食量以及结肠HE染色的影响。结果:与对照组比较,IBS模型大鼠腹部回撤反射压力阈值降低(P<0.01),排便粒数和排便含水量增加(P<0.01),敞箱垂直得分降低(P<0.01),敞箱排便粒数增加(P<0.01),摄食量降低(P<0.05)。ZXX、ZXY各剂量均可显著增加IBS模型动物的疼痛压力阈值和最大耐受压力阈值(P<0.01)。ZXX、ZXY各剂量(ZXY中剂量除外)均可显著减少模型动物2h内排便粒数(P<0.05或P<0.01);ZXX中剂量以及ZXY中、小剂量可以降低模型动物的排便含水量(P<0.05或P<0.01)。ZXX、ZXY各剂量(ZXX小剂量除外)均可显著增加模型动物的垂直得分(P<0.01),但对水平得分无显著影响(P>0.05);ZXX中、小剂量以及ZXY中剂量可减少模型动物敞箱排便粒数(P<0.05或P<0.01)。ZXY各剂量均可增加模型动物的摄食量(P<0.05或P<0.01)。HE染色结果显示,各组大鼠结肠无显著病理学和形态学的改变。结论:长期慢性应激导致IBS大鼠内脏敏感性增高、肠道动力亢进、精神活动异常以及食欲减退。ZXX、ZXY可以降低内脏高敏、抑制肠道动力亢进、改善精神活动以及增加食欲,对长期慢性应激所致IBS模型大鼠具有治疗作用。2 ZXX、ZXY对慢性应激所致IBS模型大鼠的作用机制的研究2.1 ZXX、ZXY对慢性应激所致IBS模型大鼠外周5-HT和5-HIAA的影响目的:探讨ZXX、ZXY对IBS模型大鼠结肠、血清5-HT和5-HIAA的影响。方法:将SD雄性大鼠随机分为:对照组、IBS模型组、匹维溴铵组(25 mg/kg)、氟西汀组(2.5 mg/kg)、ZXX 大、中、小剂量组(1.2 mg/kg、0.6mg/kg、0.3 mg/kg)、ZXY大、中、小剂量组(0.6mg/kg、0.3 mg/kg、0.15 mg/kg)。采用多种慢性应激相结合的方法建立IBS大鼠模型,受试药组和阳性药组动物造模同时每日灌胃给药。采用HPLC法检测各组大鼠结肠、血清5-HT和5-HIAA的含量。结果:与对照组比较,IBS模型大鼠血清、结肠5-HT、5-HIAA均明显增加(P<0.05或P<0.01),5-HT/5-HIAA比值略增加(P>0.05)。与模型组比较,ZXX、ZXY各剂量均可显著降低血清5-HT的含量(P<0.01),ZXX大、中剂量以及ZXY大、小剂量可显著降低血清5-HIAA的水平(P<0.05),ZXX大剂量以及ZXY中剂量亦可降低血清5-HT/5-HIAA比值(P<0.05);ZXY中、小剂量可显著降低结肠5-HT的含量(P<0.05或P<0.01),ZXY中剂量可显著降低结肠5-HIAA的含量(P<0.05),ZXX、ZXY小剂量亦可显著降低结肠5-HT/5-HIAA比值(P<0.05或P<0.01)。结论:ZXX、ZXY可以降低IBS模型大鼠结肠、血清5-HT、5-HIAA表达水平以及5-HT/5-HIAA 比值。2.2 ZXX、ZXY对慢性应激所致IBS模型大鼠结肠MAO-A活性的影响目的:探讨ZXX、ZXY对IBS模型大鼠结肠MAO-A活性的影响。方法:将SD雄性大鼠随机分为:对照组、IBS模型组、匹维溴铵组(25 mg/kg)、氟西汀组(2.5 mg/kg)、ZXX 大、中、小剂量组(1.2 mg/kg、0.6 mg/kg、0.3 mg/kg)、ZXY大、中、小剂量组(0.6 mg/kg、0.3 mg/kg、0.15 mg/kg)。采用多种慢性应激相结合的方法建立IBS大鼠模型,受试药组和阳性药组动物造模同时每日灌胃给药。采用比色法检测各组大鼠结肠MAO-A的活性。结果:与对照组比较,IBS模型大鼠结肠MAO-A活性显著降低(P<0.05);与模型组比较,ZXX中、小剂量和ZXY中、小剂量可以显著增加大鼠结肠MAO-A活性(P<0.05 或P<0.01)。结论:ZXX、ZXY可以抑制IBS模型大鼠结肠MAO-A表达。2.3 ZXX、ZXY对慢性应激所致IBS模型大鼠结肠TPH1 mRNA表达的影响目的:探讨ZXX、ZXY对IBS模型大鼠结肠TPH1 mRNA表达的影响。方法:将SD雄性大鼠随机分为:对照组、IBS模型组、匹维溴铵组(25 mg/kg)、氟西汀组(2.5 mg/kg)、ZXX 大、中、小剂量组(1.2 mg/kg、0.6 mg/kg、0.3 mg/kg)、ZXY大、中、小剂量组(0.6 mg/kg、0.3 mg/kg、0.15 mg/kg)。采用多种慢性应激相结合的方法建立IBS大鼠模型,受试药组和阳性药组动物造模同时每日灌胃给药。采用RT-PCR法检测各组大鼠结肠TPH1 mRNA的表达。结果:与对照组比较,IBS模型大鼠结肠TPH1 mRNA表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,ZXX小剂量以及ZXY中、小剂量可以降低结肠TPH1 mRNA的表达(P<0.05 或P<0.01)。结论:ZXX、ZXY可以显著降低IBS模型大鼠结肠TPH1 mRNA的表达水平。2.4 ZXX、ZXY对慢性应激所致IBS模型大鼠结肠SERT表达的影响目的:探讨ZXX、ZXY对IBS模型大鼠结肠SERT mRNA和蛋白表达的影响。方法:将SD雄性大鼠随机分为:对照组、IBS模型组、匹维溴铵组(25 mg/kg)、氟西汀组(2.5 mg/kg)、ZXX 大、中、小剂量组(1.2 mg/kg、0.6mg/kg、0.3 mg/kg)、ZXY大、中、小剂量组(0.6mg/kg、0.3 mg/kg、0.15 mg/kg)。采用多种慢性应激相结合的方法建立IBS大鼠模型,受试药组和阳性药组动物造模同时每日灌胃给药。采用RT-PCR法检测各组大鼠结肠SERT mRNA的表达;采用Western-blot法检测各组大鼠结肠SERT蛋白的表达。结果:与对照组比较,IBS模型大鼠结肠SERT mRNA表达水平降低(P<0.05);ZXX、ZXY各剂量对结肠SERT mRNA的表达水平无显著影响(P>0.05)。模型大鼠结肠SERT蛋白表达略有下降(P>0.05),ZXX大剂量以及ZXY中剂量具有升高结肠SERT蛋白表达的趋势(P>0.05)。结论:IBS模型大鼠结肠SERT mRNA表达水平显著降低,SERT蛋白表达水平未发生显著变化。ZXX、ZXY对IBS模型大鼠结肠SERT mRNA和蛋白表达无显著影响。2.5 ZXX、ZXY对慢性应激所致IBS模型大鼠结肠EC细胞表达的影响目的:探讨ZXX、ZXY对IBS模型大鼠结肠5-HT免疫反应阳性细胞(EC)数量的影响。方法:将SD雄性大鼠随机分为:对照组、IBS模型组、匹维溴铵组(25 mg/kg)、氟西汀组(2.5 mg/kg)、ZXX 大、中、小剂量组(1.2 mg/kg、0.6mg/kg、0.3 mg/kg)、ZXY大、中、小剂量组(0.6 mg/kg、0.3 mg/kg、0.15 mg/kg)。采用多种慢性应激相结合的方法建立IBS大鼠模型,受试药组和阳性药组动物造模同时每日灌胃给药。采用免疫组化法检测各组大鼠结肠5-HT免疫反应阳性细胞(EC)数量的变化。结果:与对照组比较,IBS模型大鼠结肠5-HT免疫反应阳性细胞(EC)数量显著增加(P<0.01);与模型组比较,ZXX、ZXY大剂量可显著降低结肠5-HT免疫反应阳性细胞(EC)数量(P<0.05)。结论:ZXX、ZXY大剂量可显著降低IBS模型大鼠结肠5-HT免疫反应阳性细胞(EC)数量。2.6 ZXX、ZXY对慢性应激所致IBS模型大鼠结肠5-HT3AR mRNA表达的影响目的:探讨ZXX、ZXY对IBS模型大鼠结肠5-HT3AR mRNA表达的影响。方法:将SD雄性大鼠随机分为:对照组、IBS模型组、匹维溴铵组(25 mg/kg)、氟西汀组(2.5 mg/kg)、ZXX 大、中、小剂量组(1.2 mg/kg、0.6 mg/kg、0.3 mg/kg)、ZXY大、中、小剂量组(0.6mg/kg、0.3 mg/kg、0.15 mg/kg)。采用多种慢性应激相结合的方法建立IBS大鼠模型,受试药组和阳性药组动物造模同时每日灌胃给药。采用RT-PCR法检测各组大鼠结肠5-HT3AR mRNA的表达。结果:与对照组比较,模型大鼠结肠5-HT3AR mRNA表达增加(P<0.01),与模型组比较,ZXY小剂量可显著降低结肠5-HT3AR mRNA表达水平(P<0.05)。结论:ZXY可显著降低IBS模型大鼠结肠5-HT3AR mRNA的表达水平。2.7 ZXX、ZXY对慢性应激所致IBS模型大鼠胃肠激素的影响目的:探讨ZXX、ZXY对IBS模型大鼠结肠VIP、SP、SS的影响方法:将SD雄性大鼠随机分为:对照组、IBS模型组、匹维溴铵组(25 mg/kg)、氟西汀组(2.5 mg/kg)、ZXX 大、中、小剂量组(1.2 mg/kg、0.6 mg/kg、0.3 mg/kg)、ZXY大、中、小剂量组(0.6 mg/kg、0.3 mg/kg、0.15 mg/kg)。采用多种慢性应激相结合的方法建立IBS大鼠模型,受试药组和阳性药组动物造模同时每日灌胃给药。采用放射免疫法检测各组大鼠结肠VIP、SP、SS的含量。结果:与对照组比较,模型大鼠结肠VIP表达水平升高(P<0.05),ZXX大、小剂量以及ZXY中、小剂量可降低结肠VIP水平(P<0.05)。各组大鼠结肠SP、SS的表达水平无统计学差异。结论:ZXX、ZXY可显著降低IBS模型大鼠结肠VIP的表达水平。2.8 ZXX、ZXY对慢性应激所致IBS模型大鼠结肠MC表达的影响目的:探讨ZXX、ZXY对IBS模型大鼠结肠MC数量的影响。方法:将SD雄性大鼠随机分为:对照组、IBS模型组、匹维溴铵组(25 mg/kg)、氟西汀组(2.5 mg/kg)、ZXX 大、中、小剂量组(1.2 mg/kg、0.6mg/kg、0.3 mg/kg)、ZXY大、中、小剂量组(0.6 mg/kg、0.3 mg/kg、0.15 mg/kg)。采用多种慢性应激相结合的方法建立IBS大鼠模型,受试药组和阳性药组动物造模同时每日灌胃给药。采用甲苯胺蓝染色法观察各组大鼠结肠MC数量的变化。结果:与对照组比较,IBS大鼠结肠MC数量显著增多(P<0.05),与模型组比较,ZXX、ZXY大剂量可显著降低IBS大鼠结肠MC数量(P<0.05)。结论:ZXX、ZXY可以显著降低IBS模型大鼠结肠MC数量。通过上述研究,可以得出以下结论:1.采用多种慢性应激相结合的方法建立IBS大鼠模型,该模型大鼠内脏敏感性升高,肠道动力亢进,精神活动异常,食欲减退,可以很好地模拟D-IBS的部分临床症状。2.ZXX、ZXY可以提高IBS大鼠腹部回撤反射压力阈值,降低排便粒数以及排便含水量,调节敞箱行为评分异常,降低敞箱排便粒数,增加摄食量,有效缓解IBS大鼠腹痛、腹泻等症状。3.IBS大鼠结肠、血清5-HT含量上升,结肠分泌5-HT的EC数量增加,结肠TPHi mRNA表达水平升高,5-HT合成功能增强;IBS大鼠结肠SERT mRNA表达降低,MAO-A活性降低,5-HT重摄取以及降解功能减弱。5-HT合成和代谢的不平衡性导致外周5-HT含量升高。ZXX、ZXY可以通过抑制EC以及TPH1 mRNA的表达,降低5-HT的合成水平,同时增强MAO-A的活性,加快5-HT的降解水平,从而降低外周5-HT的表达水平,但对5-HT的重摄取则无显著影响。4.IBS大鼠结肠5-HT3AR mRNA表达增加,ZXY可以降低5-HT3AR mRNA表达水平。5.IBS大鼠结肠VIP表达水平升高,ZXX、ZXY可以降低结肠VIP表达水平。6.IBS大鼠结肠MC数量增加,ZXX、ZXY可以通过降低结肠MC数量,从而减少MC脱颗粒释放的5-HT,使外周的5-HT水平恢复正常。7.ZXX、ZXY对D-IBS模型大鼠的治疗作用与其调节外周5-HT通路有关。