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凤梨是多年生草本植物,既是世界四大热带果树之一,也是重要的热带观赏植物。凤梨SERK1基因（AcSERK1）是凤梨体细胞胚发生的标记基因（Molecular marker gene）,在非胚性细胞（non-embryogenic cell）向胚性细胞转变过程中起重要作用,已被证明能有效提高凤梨体细胞胚发生率。因此,深入研究凤梨体细胞胚发生初期AcSERK1特异性表达调控的分子机制对揭示细胞分化、胚发生和胚早期退化等的分子机理等有着重要意义。课题组前期相关研究显示:调控AcSERK1在胚性细胞时期发生特异性表达的调控元件在5′上游-983 nt/-881 nt区。本研究在此的基础之上,通过对-983 nt/-881 nt进一步的切分和缺失分析,寻找更精确的胚性细胞特异性区段;采用生物信息学预测分析和酵母单杂交筛库的方法对胚性特异性区段互作蛋白进行了筛选,并从中挑选出两个重要候选基因,并对其在调控体细胞胚发生的作用及机制方面展开了深入研究。主要研究结果如下:1.为进一步缩小胚性细胞特异性调控元件所存在的区域,对AcSERK15′上游-983nt/-881 nt进行切分,构建了一系列植物缺失表达载体,转化凤梨愈伤组织,利用GUS瞬时表达分析技术对调控序列活性进行鉴定,结果表明:AcSERK1 5′上游-921 nt/-881nt的41个碱基序列是启动子胚性细胞特异性活性的必要区段。生物信息学分析发现,与-921 nt/-881 nt区可能存在着互作关系的主要结合位点分别为SEF3MOTIFGM、CAATBOX1、ROOTMOTIFTAPOX1;可能与之结合的转录因子主要为WRKY家族成员,还包括HDZip、KANADⅠ等其他类型的转录因子;另外,该区域内还存在一个与胚胎相关因子SEF3MOTIFGM结合的保守区域。2.以AcSERK1 5′（-921 nt/-881 nt）序列作为诱饵,构建了诱饵载体p Ab Ai-SE41,利用酵母单杂交技术从凤梨体细胞胚c DNA文库中筛选到了33个与-921 nt/-881 nt区可能存在结合关系的蛋白。蛋白功能注释表明,这些蛋白中,可能与体胚发生相关的有YABBY、LEA、HDZip、KAN等转录因子,还包括一些组蛋白和未知功能蛋白等。在进一步进行体胚发生过程中的表达量分析发现,与体胚发生关系密切的转录因子主要是Aco002761.1（HDZip）和Aco015964.1（KANADⅠ）等,分别命名为Ac HB13和Ac KAN2。3.基于凤梨基因组序列信息,克隆了Ac HB13和Ac KAN2两个基因。在凤梨愈伤组织体细胞胚诱导过程中,两个基因都能被2,4-D高效诱导,其表达在2,4-D诱导15 d的胚性愈伤组织中积累,最高可达非胚性愈伤组织中表达量的6倍和2.8倍。Ac HB13、Ac KAN2在不同组织器官中的表达量存在差异。Ac HB13和Ac KAN2都不受高温/低温胁迫诱导;Ac HB13能被ABA、MEJA、SA、Na Cl、PEG6000诱导;Ac KAN2只受Na Cl和SA的诱导,而在ABA、MEJA、PEG6000处理时受到抑制。Ac HB13和Ac KAN2定位在细胞核中。转录激活实验证实二者均具有转录激活活性,符合典型的转录因子的特征。农杆菌介导转化凤梨胚性愈伤组织得到超表达Ac HB13的7棵转基因植株,超表达Ac KAN2的8棵转基因植株。超量表达Ac HB13和Ac KAN2的转基因株系的Ac HB13和Ac KAN2的表达量明显的升高,在体细胞胚诱导过程中的AcSERK1、Ac HB13和Ac KAN2的表达量都高于野生型,同时能够提高凤梨体细胞胚发生量。4.经过原核表达进一步纯化后获得Ac HB13和Ac KAN2重组蛋白;经酵母单杂交、双荧光素酶瞬时表达分析和EMSA实验证实,Ac HB13和Ac KAN2均能和AcSERK1转录起始位点上游-921 nt/-881 nt区结合,通过结合在该区段中的CCCATA和AATTAGAC两个顺式元件,激活启动子活性,调控AcSERK1的表达;酵母双杂交和Bi FC实验证明,Ac HB13和Ac KAN2蛋白之间存在互作关系,形成二元复合物行使功能。5.通过JASPAR在线分析预测有38个的转录因子可能与与-921 nt/-881 nt区结合,其中WRKY家族的转录因子就有20个,但是在后续的酵母文库筛选中并没有筛选得到WRKY转录因子。为验证在线预测结果的可靠性,我们对凤梨中的WRKY家族成员开展了分析。结合生物信息分析和PCR实验验证,鉴定了54个凤梨WRKY家族成员,它们的表达模式不尽相同;其中51个WRKY基因不均匀地分布在25条染色体上,另外3个未被锚定。荧光定量PCR分析显示,Ac WRKY4、Ac WRKY9、Ac WRKY18、Ac WRKY30、Ac WRKY32、Ac WRKY34、Ac WRKY35、Ac WRKY52等8个WRKY基因可能参与了凤梨体细胞胚的发生;但是进一步的酵母单杂交点对点验证结果显示这8个WRKY蛋白与-921 nt/-881 nt区并不结合。综上所述,本研究在课题组前期基础之上进一步分离鉴定了AcSERK15′上游-921nt/-881 nt的41 bp为其胚性细胞特异性调控的必要区段,筛选得到了两个可能与该41bp区段结合的候选转录因子Ac HB13和Ac KAN2;初步证实Ac HB13与Ac KAN2之间存在相互作用,形成二元蛋白复合体并与AcSERK15′上游-921 nt/-881 nt区段中的两个关键元件（CCCATA和AATTAGAC）结合,影响AcSERK1启动子的转录活性,促进AcSERK1在胚性细胞中发生特异性表达,从而实现对凤梨体细胞胚发生的转录调控。