柑橘黄龙病菌基因组多样性及人工智能识别黄龙病的研究

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:bo0316
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柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是一种危害柑橘的世界性病害。柑橘植株在发病之后会发生复杂难辨的黄化症状,这阻碍了柑橘黄龙病的田间诊断和科研工作的开展。发病植株会逐渐衰败,在自然条件下在一年到数年内死亡。目前认为,引起柑橘黄龙病的病原为韧皮部杆菌属下的三个种:“Candidatus Liberibacter asiaticus”(CLas),“Candidatus Liberibacter africanus”(CLaf),“Candidatus Liberibacter americas”(CLam)。其中CLas分布范围最广,且造成危害最大。由于CLas尚未能被分离培养,因此无法通过传统的细菌研究方法对其进行研究。近几年来,随着技术的发展,利用高通量测序技术和深度学习进行生物信息学研究逐渐成为植物病原细菌研究的热门领域。本研究探索了利用基因组组装和分析方法来对CLas的加州菌群进行多样性分析,通过原噬菌体区域及多个基因位点对不同CLas菌株之间的联系进行了探究;同时基于宏基因组分析探究了柑橘木虱和柑橘微的生物类群响应黄龙病的变化;此外还探索了基于深度学习构建了柑橘黄龙病症状的识别模型,并将识别模型转移至移动终端,对其在田间条件的识别表现进行了评估。本研究取得的主要研究内容如下:1.柑橘黄龙病菌加州种群的多样性研究建立了基于原噬菌体类型、短串联重复基因位点trn、微型反向重复转座元件位点MITEs以及噬菌体相关复制终止酶基因ter L的多样性分析方法,并利用上述方法探明了CLas加州菌株之间的联系。结果表明,结合原噬菌体类型及MITEs类型可以将CLas加州种群划分为6个类群,分别为‘PTG1,A’(菌株SGCA1、SGCA5、SGpsy)、‘PTG2,A’(菌株HHCA1、HHCA2)、‘PTG1-2,B’(菌株LHCA1)、‘PTG1-3,B,A’(菌株CTCA1)、‘PTG1,B’(菌株AHCA1、AHCA2)、‘PTG1-B,A’(菌株RSCA1)。这表明不同地理位置的加州菌株可能具有不同的来源,且近两年发现的新菌株(来自LHCA1、CTCA1、AHCA1、AHCA2、RSCA1)并非原有的San Gabriel及Hacienda Height菌株(SGCA1、SGCA5、SGpsy、HHCA1)通过自然传播产生的结果。此外,基于ter L基因位点的分析结果发现,加州所有菌株均为亚洲型而非佛罗里达型。2.感柑橘黄龙病菌的柑橘木虱及植株的宏基因组学分析通过高通量测序与宏基因组分析对来自美国加州柑橘木虱样品A-AHCA1和柑橘样品C-AHCA2的微生物群落结构进行了探究。结果表明,虽然两者之间的整体微生物群体结构有着极大的差异,但细菌均为A-AHCA1和C-AHCA2的优势微生物类群。在A-AHCA1的所有微生物类群中,细菌占比为95.43%,其中变形菌门占细菌组的72.18%;在C-AHCA1的所有微生物类群中,细菌占比为58.70%,其中变形菌门(49.67%)、厚壁菌门(19.90%)、放线菌门(17.36%)为主要的细菌类群。CLas菌株AHCA1和AHCA2的基因组之间高度相似(≥99.43%)。加州柑橘样品与柑橘木虱样品之间的细菌组群体结构差异较大,不同柑橘木虱样品之间的类群差异较大,其中变形菌门为优势细菌类群,而在不同柑橘样品中的细菌类群差异较小。在柑橘样品和柑橘木虱样品中均发现了假单胞菌属、不动杆菌属、葡萄球菌属、韧皮部杆菌属、立克次氏体属的信息;柑橘样品中特有的细菌属包括弯杆菌属、细杆菌属、香味菌属、集胞藻属、Paenarthrobacter、浮丝藻属、湖丝藻属;在柑橘木虱中特有的细菌属包括军团杆菌属、沃尔巴克氏体属、Profftella、Carsonella。其中柑橘样品的不动杆菌属丰度显著高于柑橘木虱的不动杆菌属丰度(P<0.05),而立克次氏体属丰度则显著低于柑橘木虱样品组的立克次氏体属丰度(P<0.05)。3.柑橘黄龙病发病柑橘与不显症柑橘的比较宏病毒组研究通过高通量测序与宏基因组分析对黄龙病柑橘发病样品与不显症柑橘样品进行了比较病毒组分析。结果表明,发病组和不显症组总体的病毒类群丰度之间没有明显差异,病健之间、品种之间的病毒组构成没有明显差异;在发病或健康柑橘样品中鉴定到了三种柑橘病原病毒,包括柑橘衰退病毒(CTV)、柑橘曲叶类病毒(CBLVd)、柑橘碎叶病毒(CTLV),同时鉴定到了在中国柑橘上尚未被报道过的黄瓜花叶病毒(CMV)和柑橘木虱浓核病毒(Dc DNV)。对网室柑橘样品进行普查的结果发现CTV、CBLVd、CMV在柑橘群体中普遍发生,其中以CTV的检出率最高,达到56.4%,CBLVd的检出率达到27.3%,CMV的检出率为16.40%,而CTLV未见检出;对柑橘木虱样品进行普查的结果发现Dc DNV、CTV、CBLVd在柑橘木虱群体中普遍发生,CTV的检出率最高,为39.50%,Dc DNV的检出率为32.60%,而CBLVd的检出率为18.60%,CMV和CTLV在柑橘木虱样品中没有被检出。进一步研究发现,各病毒在两种宿主中存在着不同的浓度分布特点,其中在柑橘木虱样品中的检出了高浓度(CT值<25)和中等浓度(25≤CT值≤30)的Dc DNV,在所有检出样品中占比达64.29%,而在所有柑橘样品的Dc DNV检出浓度均为低浓度(CT值>30);而木虱体内检测到的CBLVd和CTV均为低浓度(平均CT值>28),CMV和CTLV在所有柑橘木虱中均无检出;基于系统发育学分析的结果表明,本研究中发现的CTLV、CTV、CMV新毒株均属于亚洲群组,而CMVsat新毒株属于欧洲类群,说明CMVsat和CMV可能来自不同的地理来源;CBLVd新毒株和南欧毒株、中东毒株亲缘较近,有别于包括中国毒株在内的亚洲毒株,说明该毒株可能来自南欧地区。4.人工智能识别柑橘黄龙病症状的研究以Tensorflow开源学习框架作为操作平台,基于大量的黄龙病发病柑橘叶片图像和健康柑橘叶片图像,通过迁移学习构建了基于Mobile Net V1和Inception V3神经网络结构的两类症状模型(M-2-C和I-2-C)和八类症状识别模型(M-8-C和I-8-C)。结果表明,在构建的4种识别模型中,以M-8-C模型的整体识别表现最优,对各类图像的平均F1分值、黄龙病图像的识别准确率分别达到了88.4%、92.5%,表明构建的深度卷积神经网络识别模型,具有有效辨别柑橘黄龙病症状的能力;M-2-C的整体识别准确率高于I-2-C,而M-8-C的整体识别准确率高于I-8-C,表明基于Mobile Net神经网络结构的识别模型的图像识别表现要优于Inception V3,且八类识别器的识别效果要优于两类识别器;八类识别器具有一定的症状细分能力,其中最优识别模型M-8-C对各类黄龙病症状的平均识别准确率为87.4%,但对黄龙病和非黄龙病造成的均匀黄化图像的真阳性检出率分别低至44.0%和64.0%,说明识别模型不能有效辨别黄龙病和非黄龙病造成的均匀黄化症状,这一点和人眼辨别效果能力相仿。识别模型能够简便地转移到手机上,且在大田环境下的识别应用取得优秀的效果。在手机上测试的结果表明,八类识别器在对各类叶片图像的识别准确率(≥68.0%)低于两类识别器(≥83.5%);但八类识别器与两类识别器在计算机上对同一批图像的识别准确率有所提高(≥86.4%,≥89.0%),这表明症状识别模型的识别表现与搭载平台的硬件计算力相关,且八类识别器对计算力的需求大于两类识别器。
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