樱桃多酚提取物对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎保护作用研究

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樱桃在我国种植历史悠久,色泽鲜艳且营养丰富,深受人们喜爱。樱桃中含有多种生物活性物质,其中多酚对人类健康发挥重要作用。多酚能清除自由基,具有抗氧化、抗炎活性,而氧化应激是许多慢性疾病和退行性病变的决定性因素,因此多酚等天然活性物质的研究为疾病的治疗提供了新的方向。溃疡性结肠炎是炎症性肠病的一种,其发病机制尚不明确。药物治疗结肠炎的毒副作用明显,易复发,增加了结肠癌变风险。由于多酚的促凋亡和抗血管生成作用,多酚可以减少炎症、抑制水肿、阻止肿瘤的发展。目前对于樱桃多酚对结肠炎的作用及机制研究较少,因此,本文测定樱桃多酚提取物的抗氧化活性,通过高效液相色谱和UPLC-ESITOF-MS/MS鉴定樱桃多酚提取物的组成,并以DSS诱导BALB/c小鼠溃疡性结肠炎为模型,探讨樱桃多酚提取物对溃疡性结肠炎小鼠的抗结肠炎作用及机制。主要研究结果如下:(1)分别提取樱桃游离酚和结合酚,Folin-Ciocalteu法测定其含量,发现樱桃中主要是游离酚,为6.71 mg GAE/g DW,占总酚的98%,而结合酚只占2%。然后,以抗坏血酸作对照,采用不同的抗氧化活性测定方法研究游离酚、结合酚的抗氧化活性大小。结果表明,相同浓度下,对于DPPH自由基清除率和铁离子还原能力,Vc与游离酚均显著高于结合酚;对于ABTS自由基清除率,结合酚显著高于游离酚和Vc;游离酚ORAC值为297μmol TE/g DW,结合酚为8μmol TE/g DW左右,游离酚的氧自由基吸收能力远高于结合酚;结合酚和Vc对超氧阴离子自由基的清除能力较弱,清除率与浓度呈正相关,游离酚呈负相关;对于羟基自由基清除率,游离酚含量与清除率显著正相关,结合酚含量与清除率无相关性。以上结果说明对于不同的测定方法,游离酚和结合酚抗氧化活性大小不同。(2)采用高效液相色谱对樱桃多酚提取物进行定性定量分析,鉴定出游离酚中含有绿原酸,矢车菊素3-O-葡萄糖苷、丁香酸、儿茶素和芦丁五种多酚。其中矢车菊素3-O-葡萄糖苷含量最高,达1276μg/g DW,其次是芦丁和绿原酸,分别为177μg/g DW和153μg/g DW,儿茶素和丁香酸含量较少,为84μg/g DW和76μg/g DW。进一步通过UPLC-ESI-TOF-MS/MS对樱桃多酚提取物进行组成鉴定,结果表明,樱桃游离酚中鉴定出花色苷类(矢车菊素3-O-葡萄糖苷、矢车菊素3-O芸香苷、芍药素3-O-芸香苷、锦葵素-己糖苷、天竺葵素3-芸香苷)、羟基苯甲酸类(原儿茶酸)、羟基肉桂酸类(咖啡酰奎宁酸、3-对香豆酰奎宁酸、阿魏酰奎宁酸、二咖啡酰奎宁酸)、黄酮醇类(槲皮素3-O-芸香苷、槲皮素、槲皮素3-O-己糖苷、槲皮素7-O-葡萄糖苷-3-O-芸香苷)和黄烷醇类(儿茶素)。结合酚中有花色苷类(飞燕草素3-O-芸香苷、天竺葵素3-芸香苷、飞燕草素-己糖苷)、羟基肉桂酸类(对香豆酸)、黄酮醇类(槲皮素3-O-芸香苷、山奈酚3-葡萄糖苷)、黄烷醇类(儿茶素)。由此得出樱桃多酚提取物中主要包含花色苷、羟基肉桂酸、黄酮醇、黄烷醇、羟基苯甲酸类。(3)以DSS诱导BALB/c小鼠溃疡性结肠炎为实验模型,探讨樱桃多酚提取物对结肠炎的保护作用。结果表明,多酚能减缓小鼠体重下降趋势,降低DAI指数,减少结肠长度的缩短;多酚还显著改善小鼠结肠粘膜组织形态,减少炎性细胞浸润,且多酚的保护作用呈剂量依赖性关系;多酚处理显著降低结肠粘膜层厚度和肌层厚度,缓解溃疡和水肿;多酚降低小鼠血清中ALT、CAT、GSH-PX水平和MDA活性,提高SOD活性,降低小鼠结肠粘膜MPO活性,降低IL-6、TNF-α水平,提高IL-10水平。综上,樱桃多酚提取物能增强机体抗氧化和抗炎能力,缓解小鼠溃疡性结肠炎,减轻炎症损伤。(4)为了进一步探讨樱桃多酚提取物抗结肠炎机制,对小鼠结肠紧密连接蛋白occludin和ZO-1进行免疫组化分析。结果表明多酚能显著提高小鼠结肠组织occludin和ZO-1蛋白含量,并且呈剂量依赖性关系;同时,通过western blot检测Wnt通路蛋白β-catenin、c-myc、Cyclin D1及GSK-3β的表达水平,结果显示多酚能降低四种蛋白含量,并且呈剂量依赖关系。综上,樱桃多酚提取物可能通过保护小鼠结肠粘膜紧密连接蛋白、维持屏障功能、抑制Wnt通路的异常激活来缓解小鼠因DSS诱导产生的溃疡性结肠炎,减轻结肠炎损伤。
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