研究背景 术后认知功能障碍（Postoperative cognitive dysfunction,POCD）是指手术后出现的中枢神经系统的并发症,主要表现为认知障碍、社交障碍、人格改变等。POCD发生的危险因素包括:高龄、麻醉因素、手术因素、术后疼痛、睡眠障碍和低学历等。其中,高龄是POCD发生的一个独立危险因素。流行病学的研究结果显示,非心脏手术患者术后7天POCD的发生率约为25.8%,而老年患者POCD的发生率可高达25-40%,至术后3个月其发生率仍可达9.9%,严重影响患者的预后,增加家庭和社会的负担。因此,如何有效地预防和治疗POCD成为国际社会关注的重要医学问题。多种神经递质及其受体的改变参与学习记忆功能障碍。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）作为中枢神经系统主要的抑制性神经递质,参与学习、记忆及突触可塑性的改变。GABA受体可由多种不同的亚基构成,且不同的GABA受体具有不同的细胞定位、生理学和药理学特性。其中,α5GABAA受体主要位于海马锥体神经元的突触外区域,占海马锥体神经元中GABAA受体的20-25%,主要参与调节强直性抑制电流和学习记忆的形成。据报道,α5GABAA受体活性的增加可促进认知功能的损伤,而降低α5GABAA受体的表达或抑制其活性可有效改善学习记忆功能的损伤。Orser et al.的研究发现,外源性给予IL-1β可上调海马神经元中α5GABAA受体的表达,增加海马CA1区的强直性抑制电流,进而导致小鼠认知功能的损伤。因此,进一步研究GABA能神经元在POCD中的作用,可为临床治疗POCD提供新的思路。中枢神经炎症反应是神经退行性疾病发生的常见因素,可引起海马依赖的学习记忆功能障碍。我们前期的研究已经证实麻醉+手术可引起老龄小鼠中枢神经炎症反应的发生,从而降低突触相关蛋白的表达,导致海马依赖的学习记忆功能的损伤。神经炎症反应是一种动态的级联反应,主要表现为中枢神经系统中天然免疫细胞的活化,并伴随多种促炎因子（如IL-1β、TNF-α、IL-6）的释放增加,最终导致中枢微环境稳态的改变。研究发现,炎症反应导致的MAPK信号通路的激活可参与调控GABAA受体的转运,进一步参与神经突触的信号传递,从而引起学习记忆功能的改变。然而,中枢神经炎症反应引起学习记忆功能障碍的具体机制尚不明确,且目前尚无可有效逆转或预防学习记忆功能障碍的治疗方法。因此,亟需进一步探讨神经炎症反应在POCD中的作用。综上所述,我们提出如下假说,麻醉+手术可引起老龄小鼠海马组织神经炎症反应的发生,继而改变GABA能神经元的功能,最终导致POCD。本研究拟采用剖腹探查术模拟临床腹部手术,建立POCD模型,采用认知行为学、分子生物学、液态核磁技术以及电生理等方法检测海马组织中GABA能神经元在老龄小鼠POCD中的作用及相关机制。研究方法和结果第一部分:海马γ-氨基丁酸和膜表面α5GABAA受体蛋白在老龄小鼠术后认知功能障碍中的表达改变方法:选择16月龄C57BL/6J雌性小鼠,随机分为空白对照组（Con组）;麻醉组（Ane组）和麻醉+手术组（Ane+Lap组）。模型构建7天后采用新异物体识别实验和条件恐惧实验检测老龄小鼠海马依赖的学习记忆功能的改变;MED64平面微电极阵列记录系统记录海马CA1区长时程增强（Long-term potentiation,LTP）幅值的改变;液态核磁技术检测海马组织中谷氨酸和GABA含量的改变;实时荧光定量PCR技术检测海马组织中GABAA受体特异型亚基α1、β3和α5 m RNA在术后第1、3、7和10天的表达改变;western blot技术检测海马组织中GAT-3、GAD65和膜表面α5GABAA受体蛋白的表达改变。结果:行为学结果显示,与Con组相比,Ane组老龄小鼠的学习记忆功能无显著改变,而Ane+Lap组老龄小鼠海马依赖的学习记忆功能出现显著下降;电生理结果显示,高频刺激（High-frequency-stimulation,HFS）可引起Con组和Ane组老龄小鼠海马CA1区LTP幅值的显著增加,而Ane+Lap组无显著改变;液态核磁检测结果显示,Ane+Lap组老龄小鼠海马组织中GABA的含量显著低于Con组和Ane组,而谷氨酸的含量无统计学差异;实时荧光定量PCR结果显示,与Con组相比,Ane组和Ane+Lap组老龄小鼠海马组织中α1和β3亚基m RNA的表达无显著改变,然而,Ane+Lap组老龄小鼠海马组织中α5亚基m RNA的表达在术后第1天开始增加,于术后第7天达到峰值;western blot结果显示,与Con组相比,Ane+Lap组老龄小鼠海马组织中GAT-3和GAD65蛋白的表达显著降低,膜表面α5GABAA受体蛋白的表达显著增加,而Ane组均无显著改变。第二部分:特异性地反向激动α5GABAA受体对老龄小鼠术后认知功能障碍的影响方法:选择16月龄C57BL/6J雌性小鼠,随机分为Con+Veh组;Con+L655,708组;Ane+Veh组;Ane+L655,708组;Ane+Lap+Veh组和Ane+Lap+L655,708组。模型构建7天后进行认知行为学检测,验证α5GABAA受体的特异性反向激动剂L655,708是否可缓解麻醉+手术引起的老龄小鼠POCD;MED64平面微电极阵列记录系统记录海马CA1区LTP幅值的改变,检测L655,708是否可改善麻醉+手术导致的老龄小鼠海马CA1区LTP的损伤。结果:行为学结果显示,与Ane+Lap+Veh组相比,L655,708可有效改善Ane+Lap+L655,708组老龄小鼠海马依赖的学习记忆功能障碍,而不影响Con+L655,708组和Ane+L655,708组老龄小鼠的学习记忆功能;电生理结果显示,与Ane+Lap+Veh组相比,L655,708可显著增加Ane+Lap+L655,708组老龄小鼠海马CA1区LTP的幅值。第三部分:P38-MAPK信号通路介导GABA能神经元功能障碍在老龄小鼠术后认知功能障碍中的作用方法:选择16月龄C57BL/6J雌性小鼠,随机分为Con组;Ane组和Ane+Lap组。模型构建7天后,运用免疫荧光技术检测老龄小鼠海马组织中小胶质细胞的形态改变;采用MSD多因子检测试剂盒检测海马组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达改变;通过western blot技术检测海马组织中P38、p-P38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2和p-JNK1/2蛋白的表达改变。检测P38-MAPK信号通路的特异性拮抗剂SB203,580对麻醉+手术引发的老龄小鼠POCD的影响;通过MED64平面微电极阵列记录系统记录给予SB203,580后,海马CA1区LTP幅值的改变;运用western blot技术检测使用SB203,580后海马组织中P38、p-P38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2、p-JNK1/2和膜表面α5GABAA受体蛋白的表达改变。结果:免疫荧光结果显示,与Con组相比,Ane+Lap组老龄小鼠海马CA1区、CA3区和DG区小胶质细胞的数量明显增加,且呈显著的激活状态,而Ane组老龄小鼠海马组织中小胶质细胞无显著的激活改变;MSD检测结果显示,与Con组相比,Ane+Lap组老龄小鼠海马组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达均显著增加,而Ane组老龄小鼠海马组织中仅TNF-α的表达显著增加,IL-1β和IL-6的表达均无统计学差异;western blot结果显示,与Con相比,Ane+Lap组老龄小鼠海马组织中p-P38蛋白的表达显著增加,P38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2和p-JNK1/2蛋白的表达均无统计学差异。然而,Ane组老龄小鼠海马组织中MAPK信号通路相关蛋白的表达均无统计学差异。行为学结果显示,与Ane+Lap+Veh组相比,SB203,580可有效改善Ane+Lap+SB203,580组老龄小鼠海马依赖的学习记忆功能障碍,而不影响Con+SB203,580组和Ane+SB203,580组老龄小鼠的学习记忆功能;电生理结果显示,与Ane+Lap+Veh组相比,SB203,580可显著增加Ane+Lap+SB203,580组老龄小鼠海马CA1区LTP的幅值;western blot结果显示,与Ane+Lap+Veh组相比,SB203,580可显著降低Ane+Lap+SB203,580组老龄小鼠海马组织中p-P38和膜表面α5GABAA受体蛋白的表达,P38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2和p-JNK1/2蛋白的表达均无统计学差异,而Con+SB203,580组和Ane+SB203,580组老龄小鼠海马组织中相关蛋白的表达均无显著改变。统计学分析所有数据均采用均数±标准误表示。两个样本间的比较采用独立样本t检验,多个样本间的比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）或双因素方差分析（Two-way ANOVA）。所有数据均使用Graph Pad Prism 7.0进行统计学分析,p<0.05认为差异具有统计学意义。研究总结 一、主要研究结果1.麻醉+手术可引起老龄小鼠海马依赖的学习记忆功能障碍和海马CA1区LTP的损伤。2.麻醉+手术可引起老龄小鼠海马组织中GABA能神经元的功能障碍,表现为GABA的含量降低;GABAA受体α5亚基m RNA的表达增加;GAT-3和GAD65蛋白的表达下降,以及膜表面α5GABAA受体蛋白的表达增加。3.麻醉+手术可引起海马组织神经炎症反应的发生,特异性地激活P38-MAPK信号通路。4.特异性地反向激动α5GABAA受体（L655,708）或抑制P38-MAPK信号通路（SB203,580）可有效缓解麻醉+手术引起的老龄小鼠POCD,且抑制P38-MAPK信号通路可下调膜表面α5GABAA受体蛋白的表达。二、研究结论本研究发现麻醉+手术可引起老龄小鼠POCD的发生,而单纯麻醉并未引起相应损伤。麻醉+手术通过引起中枢神经炎症反应的发生,特异性地激活P38-MAPK信号通路,继而上调膜表面α5GABAA受体蛋白的表达,引起GABA能神经元的功能障碍,最终导致老龄小鼠POCD的发生。针对α5GABAA受体或P38-MAPK信号通路的干预治疗可为临床预防和治疗POCD提供新的方向。三、创新之处1.证实海马组织中GABA能神经元的功能在老龄小鼠POCD模型中发生改变。2.证实中枢神经炎症反应可特异性地激活P38-MAPK信号通路,引起GABA能神经元的功能障碍,从而导致老龄小鼠POCD的发生。3.揭示特异性地反向激动α5GABAA受体或抑制P38-MAPK信号通路的激活可有效缓解POCD。四、展望1.本研究发现麻醉+手术可引起老龄小鼠海马组织中GABA的含量降低,膜表面α5GABAA受体蛋白的表达增加。使用α5GABAA受体特异性的反向激动剂L655,708可有效缓解老龄小鼠POCD,这可能为临床POCD的治疗提供新的靶点。然而,提高海马组织中GABA的含量是否可以缓解POCD有待进一步验证。2.本研究证实P38-MAPK信号通路的激活可上调膜表面α5GABAA受体蛋白的表达,从而引起老龄小鼠POCD,但是,P38-MAPK信号通路的激活是否还可引起GABA的含量和GAT-3、GAD65蛋白的表达改变有待进一步证实。3.本研究主要通过检测GABA的含量及膜表面α5GABAA受体蛋白的表达来验证GABA能神经元的功能障碍参与老龄小鼠POCD的发生,然而,GABA能突触的功能改变如抑制性突触后电流,强直性抑制电流等电信号的改变及抑制性突触相关蛋白的表达改变是否参与POCD的发生还需更深入的研究。