2019年末至2020年初,新型冠状病毒在中国乃至全球迅速蔓延[1],气溶胶作为其可能的传播途径引起广泛关注,众多研究围绕该途径迅速开展。在针对病原体气溶胶吸入感染及其防护的研究中,稳定可靠的吸入感染动物模型必不可少。美国食品药品监督管理局（FDA）的相关指南指出,我们应当利用与预估的人体暴露途径相近的方式来建立动物感染模型[2,3]。口鼻暴露途径因实验动物无需麻醉且与人类自然呼吸状态下的感染状态相似而成为病原体吸入感染研究的首选。然而建立口鼻暴露途径的动物模型必须依赖于大型专业的气溶胶口鼻暴露装置,由于欧美国家对该装置实施技术封锁与产品禁运,国内自研装置还存在种种不足,因此国内病原体吸入感染研究仍普遍采用滴鼻、气管内滴注等替代途径,气溶胶口鼻暴露动物模型的研究较为滞后,尤其对生物安全防护要求高的烈性病原体吸入感染动物模型极其匮乏。本研究旨在研制适用于高等级生物安全实验室的新一代动物气溶胶口鼻暴露系统,在此基础上选取可经气溶胶传播的烈性病原体——鼠疫耶尔森菌为模式菌,掌握其口鼻暴露系统气溶胶发生传输规律,建立其气溶胶动物口鼻暴露模型,研究其气溶胶感染损伤特性,从而形成完善的病原体气溶胶动物口鼻暴露吸入感染技术平台。新一代中小动物生物气溶胶口鼻暴露系统（NOBES）由以下四个功能模块组成:气溶胶发生模块、气溶胶暴露模块、三级生物安全柜模块和参数控制监测模块。该系统集成展现出独特的创新优势,其不同规格固定筒设计满足了多类型动物使用需求,自主研发的涡旋散射稀释器大幅提升了气溶胶传输的均匀性稳定性,多种环境参数和工程参数传感器的引入提升了系统自动化控制水平,控制软件的研发保证了较高的气溶胶控制精细度,传递舱排气管路设计增强了生物安全防护性能,独特的传递舱门设计实现了良好的人机功效。系统集成完毕后开展了一系列性能验证测试,结果表明NOBES发生的葡萄糖、粘质沙雷氏菌、鼠疫耶尔森菌液体气溶胶空气动力学质量中值直径分别为1.24±0.04μm、2.77±0.15μm,2.50±0.41μm,均在可进入人体深层呼吸道或肺泡内部气溶胶的粒径范围之内（<5μm）;NOBES发生的葡萄糖气溶胶、粘质沙雷氏菌气溶胶在暴露塔三层之间浓度分布变异系数（Coefficient of Variaton,CV）、每层各吸入口之间CV、各角度间之间CV、连续运行1 h内CV、不同日期间运行CV均符合国际经济合作发展组织指南平均浓度变异系数（CV）不超过20%[4]的要求,同时NOBES发生的葡萄糖气溶胶在每层各口均匀性（4.42%）和不同日期间重复性（0.68%）、发生的粘质沙雷氏菌气溶胶在每层各口的均匀性（最大15.12%）优于其他同类产品,说明本装置气溶胶传输均匀性稳定性达到国际领先水平;三级生物安全柜高效过滤器的整体过滤效率测试结果>99.999%,过滤效率符合国内与国际标准,表明系统具有良好的密闭性;通过装载小鼠进固定筒进行口鼻暴露测试发现,动物在系统内无异常行为出现,对口鼻暴露操作适应良好。由此可见新一代口鼻暴露系统的气溶胶传输性能、安全防护水平、自动化水平及人机工效效能均得到全面提升。随后本研究制定出NOBES的标准操作规程,性能优越的系统和标准的操作规程为后续的病原体气溶胶动物口鼻暴露研究奠定了基础。利用新研NOBES系统,我们随后开展了鼠疫耶尔森菌液体气溶胶的发生传输规律与小鼠吸入特征研究。首先进行了鼠疫耶尔森菌和粘质沙雷氏菌的液体冲击式采样器级联采样冲击测试、气溶胶发生加级联采样冲击测试,发现鼠疫菌在气溶胶采样、气溶胶持续发生加采样过程中相对于粘质沙雷氏菌的生物活性损伤率依次为160.36±11.46%,116.62±9.61%,说明鼠疫菌耐受性差,因此针对该菌的气溶胶化及采样技术需要深入研究优化。此外在测试中还发现液体冲击式采样有气溶胶逃逸现象,提示通过液体冲击采样法测试NOBES系统吸入口细菌气溶胶浓度时,需根据细菌采样冲击生物活性损伤率、逃逸率对气溶胶浓度值进行校正;其次对NOBES系统的2种气溶胶发生器、2组发生传输气流参数进行了比较研究,初步得到了鼠疫耶尔森菌气溶胶的优化传输条件,即使用Collison 12发生器且不加稀释空气;接下来测试了NOBES在优化发生传输条件下运行的鼠疫耶尔森菌液体气溶胶雾化因子（SF）,结果SF为3.28×10-7,该值优于国际大部分同行[5,6],且不随实验日期和发生液浓度而变化,反应出NOBES系统的鼠疫耶尔森菌液体气溶胶发生传输效率与稳定性俱佳;随后对发生液浓度与吸入口气溶胶浓度、小鼠肺部细菌沉积量进行直线相关与回归分析,结果发现吸入口气溶胶浓度与小鼠肺部细菌沉积量均分别与发生液浓度呈正相关,得出了相应的线性回归方程,建立了鼠疫耶尔森菌气溶胶NOBES系统吸入口浓度、小鼠吸入剂量的预测方法;最后比较了相同剂量鼠疫耶尔森菌通过气溶胶口鼻暴露、气溶胶肺递送、鼻内滴注三种途径感染BALB/c小鼠10min后的细菌体内组织分布规律,发现气溶胶口鼻暴露途径在呼吸系统中的细菌组织分布最广,肺部沉积率最低,肺部沉积颗粒物粒径更小,细菌从肺转移至其他脏器速率更快,同时仅该途径在侵染呼吸系统同时还同时侵染消化道、脑组织,因此其吸入感染动物模型具有其独特性,无法用其他途径取代。通过上述研究,我们初步掌握了鼠疫耶尔森菌液体气溶胶在NOBES系统内的发生传输特点和小鼠吸入特征。最后利用上述的优化传输条件开展了鼠疫耶尔森菌液体气溶胶经口鼻暴露感染BALB/c小鼠的损伤特性研究。首先进行了半数致死量测试,结果表明NOBES鼠疫耶尔森菌液体气溶胶BALB/c小鼠口鼻暴露感染的LD50为155CFU,95%置信区间为74-283CFU。随后以（1.15±0.56）×105CFU的鼠疫耶尔森菌经气溶胶口鼻暴露途径感染小鼠吸入,结果显示,小鼠肺、脾、血中的细菌载量随时间的递增呈逐渐增加趋势,其血清、肺、脾匀浆液的C反应蛋白、血清淀粉样P物质和细胞因子（如IFN-γ、IL-6等）水平随时间的递增总体上呈逐渐增加趋势,相比于生理盐水对照组,实验组小鼠在攻毒后48 h或60 h两个时间点肺、脾病理改变明显,表现为肺水肿、肺出血、肺组织散在弥漫性结节改变、脾炎性坏死等,说明鼠疫耶尔森菌液体气溶胶感染小鼠后,在小鼠体内不断增殖扩散,引起小鼠肺和脾病理改变,并诱导机体产生较强的天然免疫反应。上述研究表明我们成功建立了鼠疫耶尔森菌液体气溶胶小鼠口鼻暴露感染模型。综上所述,本研究攻克了病原体气溶胶动物口鼻暴露技术面向高等级生物安全实验室实际应用的系列关键技术问题,研制出新一代中小动物生物气溶胶口鼻暴露系统,全面提升了系统的气溶胶传输性能、生物安全防护水平、自动化水平及人机工效效能。随后本研究通过系列实验掌握了该系统传输鼠疫耶尔森菌液体气溶胶的传输特性与小鼠吸入分布特征,并利用优化的传输条件成功建立了鼠疫耶尔森菌液体气溶胶小鼠口鼻暴露感染模型,为呼吸道传播病原体感染机制研究以及疫苗与药物评价提供了关键的硬件与技术支撑。