日本鳗鲡(Anguilla japonica)是中国主要的鳗鲡养殖品种之一。在目前高密度集约化养殖过程中病害时有发生,反复使用抗生素等化学药物防治疾病导致耐药致病菌株的出现等一系列严重的问题,寻找天然、高效、广谱和细菌不易产生耐药性的药物来替代传统化学药物是鱼病防治研究的重要方向之一。鱼类的非特异性免疫因子,尤其是抗菌肽,因其天然性、抗菌谱广、抗菌活性强等诸多优点,且其作用机理主要是通过破坏细菌细胞膜,导致细胞内含物外泄而杀灭细菌,细菌难以对其产生耐药性,因而有望替代传统抗生素类药物,抗菌肽的研究已成为医药及分子免疫学的研究热点。本论文比较日本鳗鲡不同组织器官的抗菌活性,并分析其抗菌活性组分,在此基础上选择抗菌活性较大的肝脏采用液相色谱进行分离纯化,获得纯度较高的抗菌肽类物质。1.鳗鲡不同组织器官抗菌活性比较及抗菌组分分析:用10%醋酸提取日本鳗鲡肝脏、鳃、脾脏、胆汁、肾脏和血清中的抗菌活性物质,检测其对养殖鳗鲡常见的四种致病菌,即肠杆菌Enterobacter sp.(B01)、迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda (B09)、气单胞菌属Aeromona sp. (B18)和嗜水气单胞菌Aeromona hydrophila (B27)的抑杀作用。结果显示,肝脏、脾脏、胆汁和鳃的样品对四株试验菌株均有明显的抑菌作用,肾脏对B18、B27和B01三株致病菌有抑菌作用,血清仅对B18有抑菌作用。不同样品对同一种致病菌的抗菌活性差异显著(P<0.05),按平均抑菌圈半径计算,其抗菌活性大体呈现为:肝脏>鳃>脾脏>胆汁>肾脏>血清。同一样品对不同细菌的抑杀作用差异显著(P<0.05)。采用反相高效液相色谱法分析上述各组织器官的醋酸提取物中的活性组分,结果显示:肝脏、脾脏、胆汁和鳃样品中的活性组分(以杀伤指数大于50%计)主要集中于乙腈洗脱浓度为19.4%-35.4%,肾脏和血清中组分无明显抗菌活性(杀伤指数小于50%)。本研究为以后研究鳗鲡等鱼类抗菌活性组分提供重要的参考依据。2.鳗鲡肝脏中抗菌肽的分离与鉴定:采用10 kDa纤维柱切向流超滤10%醋酸提取日本鳗鲡肝脏的抗菌活性物质,检测其对养殖鳗鲡常见的四株致病菌B01、B09、B18、B27的抑杀作用。结果显示,小分子蛋白(<10 kDa)抗菌活性大于大分子蛋白(≥10 kDa部分)抗菌活性,但是两部分抗菌活性无显著性差异(P>0.05);同一部分样品对不同菌株抗菌活性也各不相同,对B18菌的抑杀作用最强。对小于10 kDa部分采用阳离子交换层析和反相高效液相色谱层析等方法进一步层析得到分子量大约为2.5 kDa电泳纯抗菌肽,杀伤指数为99.4%,MALDI-TOF-MS质谱分析结果显示该抗菌物分子量在2-3 kDa之间,说明并非单一蛋白,有待于进一步分离。