【摘 要】
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目的:慢性髓细胞白血病（Chronic Myeloid Leukemia,CML）是一种骨髓增生性肿瘤,其特征是形成费城染色体并产生BCR-ABL融合蛋白,具有显著增强的酪氨酸激酶活性。伊马替尼（Imatinib,IM）作为临床上CML患者的一线药物治疗效果良好,但仍有25%以上的CML患者对IM耐药导致治疗失败,并且对于急变期的CML患者来说,IM的治疗效果不佳。长期以来,DNA损伤被认为是癌症
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目的:慢性髓细胞白血病（Chronic Myeloid Leukemia,CML）是一种骨髓增生性肿瘤,其特征是形成费城染色体并产生BCR-ABL融合蛋白,具有显著增强的酪氨酸激酶活性。伊马替尼（Imatinib,IM）作为临床上CML患者的一线药物治疗效果良好,但仍有25%以上的CML患者对IM耐药导致治疗失败,并且对于急变期的CML患者来说,IM的治疗效果不佳。长期以来,DNA损伤被认为是癌症发生的原因之一,不适当的DNA修复可能通过抑制肿瘤因子的失活或致癌基因的激活导致细胞的恶性转化。在CML患者中,BCR-ABL的表达使产生的活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）水平增加从而导致DNA双链断裂（DNA double-strand breaks,DSBs）,而CML细胞更倾向利用异常修复途径（Altnative end-joining,Alt-EJ）来修复DSBs。文献报道片状核酸内切酶（Flap endonuclease 1,FEN1）作为Alt-EJ的候选蛋白在多种实体瘤中高表达,而FEN1在CML细胞中的表达情况尚未可知。因此本研究拟检测FEN1在CML细胞中的表达水平,探究靶向FEN1对CML细胞生物学效应的影响并验证FEN1是否参与Alt-EJ途径。方法:1.利用RT-q PCR和Western blot分别检测FEN1在CML细胞株和CML病人中的表达,Western blot检测FEN1的表达是否受BCR-ABL活性的影响。2.利用慢病毒对K562（IM敏感）和K562/G01（IM耐药）细胞中的FEN1进行稳定敲低,并通过相关实验检测其生物学效应的改变。3.利用Western blot和免疫荧光检测CML细胞中的γH2AX的含量,以反映CML中DSBs的情况;采用分层萃取和免疫印迹的方法分析在诱导DSBs的情况下,参与经典非同源末端连接（Classical Non Homologous End Joining,c-NHEJ）途径和Alt-EJ途径已知的经典蛋白以及FEN1蛋白的FⅠ-FⅣ层分布谱;采用基于线性质粒的细胞内修复实验来检测敲低FEN1后细胞对DSBs修复途径的影响,通过CO-IP实验来检测在DSBs修复中,FEN1与其它修复蛋白的互相结合情况。结果:1.首次观察到FEN1在CML细胞及CML初诊病人的骨髓标本中高表达,并发现FEN1的水平不受BCR-ABL的影响。2.与对照组相比,在K562和K562/G01细胞中敲低FEN1的表达会抑制细胞增殖和促进凋亡,联用NU7441和IM会增强此效应;敲低FEN1的表达导致CML细胞累积更多未修复的DSBs。3.CML细胞具有更多的自发性DSBs产生以及CML细胞c-NHEJ中关键蛋白KU70和LIG4水平降低;提取未经Calicheamicin（Cali）或者经Cali处理的K562和K562/G01细胞F1到F4层蛋白,发现FEN1的变化谱与Alt-EJ途径中蛋白保持一致。通过线性质粒修复实验发现敲低FEN1的表达后Alt-EJ途径活性降低,说明FEN1参与了Alt-EJ途径;CO-IP和Western blot实验证明FEN1在参与DSBs时,是以LIG1/FEN1/PCNA结合的方式发挥作用。结论:我们首次报道了FEN1在CML中高表达并且验证了FEN1参与了Alt-EJ途径,抑制FEN1对IM敏感细胞和耐药细胞的CML治疗均有积极作用,FEN1可以作为CML治疗选择中有希望的靶点。
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