【摘 要】
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目的BCR-ABL融合基因编码产生BCR-ABL蛋白,其酪氨酸激酶活性持续异常活化下游信号通路,导致CML的发生。尽管酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKIs）伊马替尼（Imatinib,IM）等药物的使用延长了患者的生存期,但仍有约25%的病人产生耐药,临床急需新的治疗手段。核不均一核糖核蛋白（Heterogeneous ribonucleoprotein
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目的BCR-ABL融合基因编码产生BCR-ABL蛋白,其酪氨酸激酶活性持续异常活化下游信号通路,导致CML的发生。尽管酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKIs）伊马替尼（Imatinib,IM）等药物的使用延长了患者的生存期,但仍有约25%的病人产生耐药,临床急需新的治疗手段。核不均一核糖核蛋白（Heterogeneous ribonucleoprotein,hnRNP）是一类RNA结合蛋白,参与细胞内mRNA的剪切、成熟、转运、稳定及翻译调控等过程。近年来,hnRNP家族多个成员被证实在慢性髓细胞白血病（Chronic myeloid leukemia,CML）中发挥重要作用。其中hnRNP U自1992年被发现以来,已证实它与多种实体肿瘤发生发展相关,但在CML中的研究尚未见报道。为了使本研究对CML具有普适性,我们考虑了IM敏感和IM耐药两种临床现状。故本课题拟采用IM敏感细胞株K562及IM耐药细胞株K562/G01细胞为模型,探究hnRNP U在CML中的作用及可能的机制,为探寻CML的发病机制和治疗新思路提供实验基础。方法1.采用RT-qPCR和Western blot分别检测正常对照（NC）及CML患者骨髓标本,BCR-ABL阴性细胞株TK6、THP1,BCR-ABL阳性细胞株K562、KCL22、K562/G01中hnRNP U的表达;再用不同浓度伊马替尼处理K562及K562/G01细胞48 h后,Western blot检测BCR-ABL磷酸化水平及hnRNP U蛋白水平的变化。2.采用sh-hnRNP U慢病毒感染K562及K562/G01细胞72-96 h,RT-qPCR检测hnRNP U mRNA敲低效果,经嘌呤霉素筛选4天后Western blot检测hnRNP U蛋白敲低效果。选取敲低效果较好的sh RNA-1、sh RNA-2慢病毒感染K562及K562/G01 96 h,采用CCK8和克隆形成实验检测细胞的增殖能力;sh RNA-1、sh RNA-2慢病毒感染K562及K562/G01细胞96 h经嘌呤霉素筛选并继续培养4-5天后,用流式细胞术检测细胞的凋亡。3.利用生物信息学技术筛选hnRNP U的潜在靶基因;RT-qPCR及Western blot检测hnRNP U敲低后相应靶基因mRNA、蛋白表达水平及mRNA半衰期;RIP实验检测hnRNP U与靶基因mRNA的结合。结果1.与正常人骨髓标本和BCR-ABL阴性细胞株相比,hnRNP U在CML患者骨髓标本（P<0.001）和CML细胞系中高表达（P<0.05）,hnRNP U表达水平不受BCR-ABL磷酸化水平的影响。2.病毒感染细胞72-96 h,hnRNP U mRNA敲低至50%以下,经嘌呤霉素筛选后hnRNP U蛋白显著降低。CCK8结果显示48 h时,sh-hnRNP U组细胞增殖速率明显变缓（P<0.05）;克隆形成实验显示sh-hnRNP U组克隆数量减少约50%且克隆形态明显变小,表明hnRNP U敲低,CML细胞增殖能力明显受抑（P<0.001）。流式结果显示CML细胞发生凋亡。3.利用GEPIA和STARBASE3.0两个数据库,筛选出与hnRNP U正相关、且与hnRNP U有可能结合的mRNA有c-Myc和BCL-2;hnRNP U敲低后c-Myc和BCL-2的mRNA表达水平及mRNA稳定性均降低,c-Myc和BCL-2蛋白表达水平也降低;RIP实验发现hnRNP U可以结合c-Myc和BCL-2的mRNA。结论本研究发现hnRNP U在CML病人骨髓标本和CML细胞系K562、KCL22、K562/G01中表达增高,高表达的hnRNP U可促进CML细胞增殖并抑制其凋亡,其可能的机制是通过hnRNP U与c-Myc和BCL-2的mRNA结合并增强其mRNA稳定性,促进c-Myc及BCL-2蛋白表达来实现的。研究表明hnRNP U对于IM敏感及耐药的CML细胞株的存活同样重要,为深入阐明hnRNP U在CML发病中的作用奠定了实验基础。
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