论文部分内容阅读
大豆(Glycine max(L.)Merr.)是光周期敏感的短日双子叶植物。目前对大豆光周期分子机制的研究集中在开花促进基因上,而对开花抑制基因的研究较少。FT家族基因是光周期反应中的整合因子,目前发现大豆有10个FT同源基因,其中GmFT1a是第一个被证实具有开花抑制作用的大豆FT同源基因。E1作为豆科植物特有的基因,长日下能诱导GmFT1a的表达,但是诱导机制尚不明确。本研究通过对GmFT1a启动子克隆并进行研究,由此揭示GmFT1a分子机制,为大豆光周期开花分子机制提供理论依据。本实验以自贡冬豆为材料克隆了GmFT1a的启动子,并进行生物信息学分析。将克隆的启动子构建表达载体并转化拟南芥植株,对转基因拟南芥进行染色和实时荧光定量检测GUS的表达部位和表达量。将表达载体共转拟南芥原生质体完成双荧光素酶实验检测以E1与GmFT1a的关系,测定长/短日下E1 RNAi植株中的GmFT1a表达量。主要结果具体如下:1.以自贡冬豆为材料克隆了片段大小为4971 bp的GmFT1a启动子,生物信息学分析发现该片段共有19个光响应元件,且集中分布在5个区域;与参考基因组启动子对比发现该片段有20处碱基的插入和缺失。2.构建pGFP-GmFT1a pro-GUS表达载体并转化拟南芥,筛选阳性植株并对其莲座叶、根、花和荚果4个部位进行GUS染色和实时荧光定量检测。GUS染色发现这4个部位均能被染上色,且除了根部以外,其余部位随着驱动的启动子增加,染色范围和强度也增加;实时荧光定量PCR检测发现,GUS各部位中均有表达,但在根中的表达量最低,且随着驱动的启动子大小增加,除根外其余部位表达量也相应增加。说明GmFT1a启动子驱动GUS基因在各部位均有表达,除根部外,其余部分随着启动子片段增加表达量也会增加。3.为探究GmFT1a的上游基因,测定了E1 RNAi植株在长日和短日条件下GmFT1a的表达量,结果发现在两种环境下,GmFT1a表达量相对于野生型均显著降低,说明当E1表达受到抑制时,GmFT1a的表达也会受到抑制。4.利用酶解法制备拟南芥原生质体,设置缺失组并构建多个pGreenII-0800-GmFT1a pro-LUC表达载体,并和p16318-E1表达载体并共转入拟南芥原生质体,并检测荧光信号,发现当有p16318-E1载体存在时,荧光信号显著增加,说明当有E1存在时,GmFT1a的启动子活性显著增加。推测E1可能通过GmFT1a启动子调控其表达。综上结果说明,GmFT1a启动子在拟南芥各部位均表达,但在莲座叶和花中表达量最高,且E1可能调控GmFT1a的表达,正向调控GmFT1a的表达。