论文部分内容阅读
目的:随着人口老龄化基数的不断增加,骨质疏松症等慢性病的发病率越来越高,同时老年人群中男女比例失衡,每年因绝经导致的骨质疏松病症更为突出,其绝经后骨质疏松引起骨折的发生率也居高不下,这些已成为当前医疗和社会的重大健康问题。运动是良医,适宜的运动对于人体机能、代谢具有一定正向效益,负重跑台运动作为抗阻力运动之一,既可以正向调控骨骼肌的质量,也可以调控骨代谢,改善骨骼的生长发育。超声作为一种物理声波,在临床和基础实验研究方面:针对骨组织的干预主要体现在低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)干预骨折的物理理疗方面,但运动联合LIPUS干预骨质疏松和骨损伤的效果及潜在肌骨耦联机制却鲜有研究。本实验以大鼠股骨和骨细胞为研究对象,通过构建骨质疏松和骨损伤模型,研究负重跑台运动联合LIPUS对去卵巢大鼠骨质疏松改善和骨损伤愈合的效果及潜在的肌骨耦联机制,以期为临床上防治骨质疏松,特别是绝经后骨质疏松骨损伤的治疗提供创新性方法和实验依据。方法:本研究的动物实验:采用70只3月龄的SD健康雌性大鼠为实验对象,适应性饲养一周并进行随机分组:假手术组(Sham Operation,Sham),去卵巢组(Ovariectomized,OVX),OVX组在去卵巢术后恢复两周进行随机分组:去卵巢安静组(Ovariectomized,OVX),去卵巢负重跑台运动组(Ovariectomized and Weight-bearing training,OWT),去卵巢超声干预组(Ovariectomized and Drilling and Ultrasound,ODU),去卵巢负重跑台运动超声联合组(Ovariectomized and Weight-bearing training and Drilling and Ultrasound,OWTDU)。OWT 组进行速度20min/m,6d/w,20min,连续运动10w。1Ow的负重跑台运动结束后Sham组、OVX组和OWT组均采取8只大鼠进行处死,采集血清以及相关组织以备后续检测使用。剩余各组大鼠右侧股骨中段均进行骨损伤手术,构建骨损伤模型。建模成功后,ODU组和OWTDU组进行LIPUS治疗,其超声声强30mW/cm2,中心频率1.5MHz,时间20min/d,连续干预21d。本实验中每周周日上午采集体重,取材前各组大鼠进行抓力测试和活体骨密度检测,使用生化试剂盒检测血清的ALP,StrACP,E2,MSTN的活性及含量。Micro-CT检测股骨远端松质骨区域和股骨中段骨损伤区域的骨微结构,三点弯曲力学试验检测股骨中段的生物力学性能,H&E染色分析股骨远端形态学变化,Western Blot和RT-qPCR技术分析各组肌骨耦联机制,即骨骼肌MSTN介导的信号通路和骨组织胞内Wnt/β-catenin信号通路传导的基因及蛋白表达情况。本研究的细胞实验以成骨细胞MC3T3-E1和破骨细胞Raw264.7为研究对象,低强度脉冲超声干预方式下,MC3T3-E1细胞随机分为对照组(Control)和超声干预组(LIPUS);机械牵拉干预下,MC3T3-E1细胞随机分为对照组(normal control,NC)和牵拉刺激组(strain,ST)。每组干预结束后进行CCK-8检测细胞增殖,ALP活力检测评估细胞分化,以及茜素红染色检验细胞矿化结果;检测LIPUS干预破骨细胞Raw264.7的增殖。结果:1.大鼠常规指标中体重、抓力、股四头肌湿重、股骨湿重、子宫湿重以及活体骨密度结果:去卵巢手术12w后大鼠体重显著增加(P<0.01),活体双侧股骨BMD、子宫和股四头肌湿重以及抓力极显著下降(P<0.01),负重跑台运动后较OVX组体重显著下降(P<0.05),BMD(P<0.05)和抓力(P<0.01)以及股四头肌湿重(P<0.05)显著增加(P<0.05)。在21d LIPUS干预后,与OD组相比较,ODU组、OWTD组和OWDTU股四头肌湿重显著增加(P<0.01)。2.大鼠血清指标结果:去卵巢手术12w后OVX组大鼠血清中ALP活性(P<0.01)和StrACP含量显著增加(P<0.01),E2含量显著下降(P<0.01),经10w负重跑台运动干预后ALP活性和E2含量均显著增加(P<0.01),StrACP含量显著下降(P<0.01)。在21d LIPUS干预后,前期运动组ALP活性显著增加(P<0.05)、StrACP含量(P<0.01)和E2含量(P<0.05)均显著下降,超声组ALP活性极显著增加(P<0.01),StrACP含量和2含量极显著下降(P<0.01),运动联合超声组干预效果优于单一干预组。3.大鼠股骨远端松质骨BMD和骨微结构结果:去卵巢手术12w后大鼠股骨远端松质骨BMD、Tb.N、Tb.Th、BV/TV均显著下降(P<0.01),而Tb.Sp指标显著增加(P<0.01),负重跑台运动后较OVX组BMD和BV/TV显著增加(P<0.05)、Tb.N极显著增加(P<0.01),Tb.Sp指标显著降低(P<0.01);在21d LIPUS干预后,前期运动组Tb.N显著增加(P<0.05),BMD和Tb.Th极显著增加(P<0.01),Tb.Sp指标显著降低(P<0.05);超声组BMD和Tb.Th极显著增加(P<0.01),Tb.Sp显著降低(P<0.05),运动联合超声组在BMD、Tb.N和Tb.Sp方面优于单一干预组。4.大鼠股骨中段的生物力学性能结果:在去卵巢手术12w后大鼠股骨中段的最大载荷、刚度、能量吸收和弹性模量均极显著下降(P<0.01),负重跑台运动后较OVX组最大载荷、刚度、能量吸收和弹性模量均极显著提升(P<0.01)。在21d LIPUS干预后,前期运动组的最大载荷(P<0.01)、能量吸收(P<0.01)和弹性模量(P<0.05)显著增加;超声组最大载荷(P<0.01)、刚度(P<0.05)、能量吸收(P<0.05)和弹性模量(P<0.05)均显著增加;两者联合组干预与单一组没有显著差异。5.大鼠骨损伤的愈合结果:在21d的LIPUS干预情况下,OD组大鼠骨愈合程度显著缓慢(P<0.01);与OD组比较,运动组和超声组以及两者联合组骨愈合程度极显著提升(P<0.01),但两者联合组与单一干预组没有显著差异。6.Myostatin的表达结果:在去卵巢手术12w后大鼠血清Myostatin含量及股四头肌Myostatin蛋白表达结果极显著增加(P<0.01);负重跑台运动后较OVX组大鼠血清Myostatin含量及股四头肌Myostatin蛋白表达结果极显著下降(P<0.01);在21d LIPUS干预后,前期运动组和超声干预组均显著降低了血清Myostatin含量及股四头肌Myostatin的蛋白表达(P<0.01),但只有在股四头肌Myostatin的蛋白表达结果中,两者联合组显著低于单一干预组(P<0.05)。7.大鼠Myostatin介导的信号通路和Wnt/β-catenin信号通路中基因和蛋白表达结果:在去卵巢手术12w后大鼠的Myostatin受体ActRⅡB和下游关键分子Smad2/3、GSK-3β的蛋白和基因表达均极显著增加(P<0.01或P<0.05),Wnt/β-catenin信号通路中的Wnt1、β-catenin分子的蛋白和基因表达极显著下降(P<0.01或P<0.05),即去卵巢后大鼠的Myostatin信号通路被促进,而Wnt/β-catenin信号通路被抑制;负重跑台运动后可有效抑制Myostatin信号通路,效激活Wnt/β-catenin信号通路;在21 d的LIPUS干预中,超声组可有效抑制Myostatin信号通路,激活Wnt/β-catenin信号通路,两者联合在ActRⅡB、Wnt1、GSK-3β和β-catenin在基因和蛋白表达水平显著优于单一干预组。8.成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化、矿化结果:牵拉应力参数在应变力2000ustrain,频率0.5Hz,时间120min时MC3T3-E1细胞增殖活性具有极显著增加(P<0.01);LIPUS干预MC3T3-E1细胞3d、5d、7d,增殖活性均具有显著性提高(P<0.01);牵拉应力刺激和LIPUS干预MC3T3-E1细胞ALP活性显著性增加(P<0.01);通过茜素红染色法进行评估,牵拉应力刺激和LIPUS干预MC3T3-E1细胞14d、21d和28d可加速其矿化结节的形成。9.破骨细胞Raw264.7增殖结果:LIPUS干预破骨细胞Raw264.7增殖活性在干预5d具有显著抑制作用(P<0.05),在LIPUS干预7d具有极显著抑制增殖作用(P<0.01)。结论:1.去卵巢手术12w后,骨质疏松模型建立成功;且负重跑台运动有助于延缓去卵巢所带来的骨量下降、骨微结构的破坏和骨生物力学性能的减弱;2.LIPUS治疗骨损伤的去卵巢大鼠可显著促进骨孔愈合,改善其结构和力学性能,同时在骨损伤后运动终止的21d内其显著加快骨损伤愈合速度,两者联合干预加强骨损伤的修复过程,有优于单一干预方式的趋势但没有显著性差异;3.负重跑台运动和LIPUS改善骨质量,加速骨损伤愈合的潜在肌骨耦联分子机制可能是:通过抑制骨骼肌内Myostatin表达进而减少其与骨组织细胞内的受体的结合,同时激活Wnt/β-catenin信号通路共同作用来实现的;4.牵拉应力刺激和LIPUS干预MC3T3-E1细胞可显著促进其增殖、分化和矿化;且LIPUS干预破骨细胞Raw264.7在5d可显著抑制其增殖活性,7d进一步加强抑制效应且具有极显著性差异。