论文部分内容阅读
过氧化氢酶(CAT，EC1.11.1.6)是动植物组织中最重要的抗氧化酶之一，其能催化过氧化氢分解为分子氧和水。近来，许多研究表明一些病理状态（如糖尿病、衰老、氧化应激和癌症）与CAT的失活有关。而环境中污染物的摄入可能会影响生物体内CAT的催化活性。由于环境污染物的毒性效应始于与功能性生物大分子的结合，因此对环境污染物与生物大分子相互作用的基础研究显得尤为重要。尽管针对一些环境污染物与CAT在体外相互作用的研究已有开展，但重要环境污染物对CAT的毒性机制还远远未被揭示。因此，本研究关注于典型PAHs和重金属汞(Hg)、铬(Cr)对CAT的毒性作用。为揭示相关机制，需要了解PAHs和Hg、Cr是如何与CAT作用的，以及其相互作用对CAT结构和活性的影响。本论文的主要研究内容和结果包括以下几个方面: (1)利用荧光、紫外-可见吸收和圆二色光谱法研究了模拟条件下(Tris-HCl缓冲液，pH=7.40)1-羟基萘(1-OHNap)、9-羟基菲(9-OHPhe)和1-羟基芘(1-OHPyr)与CAT的相互作用。结果表明，1-OHNap通过混合猝灭机制使CAT内源荧光猝灭，而9-OHPhe和1-OHPyr对CAT荧光的猝灭属于静态猝灭。1-OHNap、9-OHPhe和1-OHPyr均可与CAT形成1∶1的复合物，在290 K下其结合常数分别为6.31×103、1.03×104和2.96×105 L mol-1。热力学分析表明氢键和范德华力是形成三种复合物的主要作用力。根据F(o)rster非辐射能量转移理论，1-OHNap、9-OHPhe和1-OHPyr与CAT之间的平均结合距离分别为3.28、4.06和3.48 nm。同步荧光、紫外-可见吸收和圆二色光谱分析表明1-OHNap-CAT、9-OHPhe-CAT和1-OHPyr-CAT复合物的形成均可引起CAT构象的改变。在一定浓度范围内(0-1.0×10-5 mol L-1)，1-OHNap、9-OHPhe和1-OHPyr对CAT活性的影响程度顺序为1-OHNap＜9-OHPhe＜1-OHPyr，其中1-OHNap和1-OHPyr可抑制CAT的活性，而9-OHPhe对CAT活性有促进作用。 (2)利用分子对接法研究了三种母环PAHs(萘(Nap)、菲(Phe)和芘(Pyr))及其羟基代谢物(1-OHNap、9-OHPhe和1-OHPyr)与CAT的相互作用。结果表明，三种母环PAHs(P-PAHs)及其羟基代谢物(OH-PAHs)可结合到CAT的不同位点。1-OHNap与ASN323和PHE325残基，9-OHPhe与ASN368和GLN371残基，以及1-OHPyr与ASN323和PHE325残基均可形成氢键;而三种P-PAHs与CAT氨基酸残基之间均无氢键形成。通过对接计算得到Nap-CAT、Phe-CAT、Pyr-CAT、1-OHNap-CAT、9-OHPhe-CAT和1-OHPyr-CAT体系的结合常数分别为1.16×104、1.89×105、5.40×105、2.91×104、1.90×105和1.41×106 L mol-1，表明OH-PAHs与CAT的结合能力要强于P-PAHs。总体上，PAHs与CAT的结合能力与PAHs的辛醇/水分配系数(logKow)呈正相关。 (3)在模拟条件下，利用荧光、紫外-可见吸收和圆二色光谱法结合分子对接法研究了无机二价汞离子(Hg(Ⅱ))与CAT的相互作用。荧光猝灭分析表明Hg(Ⅱ)可通过静态猝灭机制使CAT内源荧光猝灭。Hg(Ⅱ)可与CAT结合形成Hg(Ⅱ)-CAT复合物，在295 K下其结合常数为13.24 Lmol-1。热力学分析表明电荷作用力是该复合物形成的主要作用力。紫外-可见吸收和圆二色光谱分析表明Hg(Ⅱ)-CAT复合物的形成可引起CAT构象变化，在低浓度和高浓度Hg(Ⅱ)存在下可分别增加和降低CAT的α-螺旋含量。Hg(Ⅱ)可明显抑制CAT的活性，在5.0×10-4mol L-1Hg(Ⅱ)存在下CAT的活性降低了67.2％，且CAT的相对活性值与其荧光强度值呈现良好的线性关系。用分子对接法进一步研究了不同形态的Hg(Ⅱ)(HgCl2，[HgCl3]-和[HgCl4]2-)与CAT的结合作用。结果表明，HgCl2，[HgCl3]-和[HgCl4]2-在CAT内的结合位点存在较大差异，三者与CAT的结合强弱也不同。 (4)在模拟条件下，利用多种光谱法结合分子对接法研究了不同价态的Cr(Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ))与CAT的相互作用。荧光分析表明Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)均可使CAT荧光发生猝灭，且分别属于动态猝灭和静态猝灭机制。Cr(Ⅵ)可与CAT形成复合物，在298 K下其结合常数为3.44×104 L mol-1。此外，热力学和分子对接分析表明电荷作用力是形成Cr(Ⅵ)-CAT复合物的主要作用力，而范德华力也不可忽略。根据F(o)rster非辐射能量转移理论，Cr(Ⅵ)和CAT的平均结合距离为3.55 nm。分子对接结果表明Cr(Ⅵ)在CAT中的结合位点靠近CAT的中心区域，与Cr(Ⅵ)距离在4(A)内的氨基酸残基有9个。模拟计算得到Cr(Ⅵ)和CAT的结合常数为3.03×104 L mol-1，与实验值相近。同步荧光、紫外-可见吸收和圆二色光谱分析表明Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)均可使CAT构象发生改变，但影响程度存在差异。低浓度时，Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)均可促进CAT的活性，但浓度增加到一定值时对CAT活性的促进作用减弱甚至无促进。 综上，本文在分子水平上推进了对P-PAHs、OH-PAHs、Hg(Ⅱ)、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)对CAT致毒机制的阐释，有助于了解这些环境污染物对生物体内抗氧化酶体系的毒性作用机制。