脊髓性肌萎缩症(SMA)是新生儿致死率较高的单基因遗传疾病之一,具有高携带率、高死亡率的特点。SMN1基因的突变或缺失是SMA的主要发病原因。目前针对SMA的治疗手段非常有限,且价格极度昂贵,国内患者面临无药可用的境地。基因治疗为脊髓性肌萎缩症的治疗甚至治愈创造了可能性。本文以脊髓性肌萎缩症为研究对象,开展基因治疗药物分子设计和基因元件的优化。首先以CA启动子为基础启动子,构建了4种嵌合不同5’非翻译区内含子(5’-UTR intron)序列的嵌合型新启动子,经体外荧光素酶和绿色荧光蛋白表达对比,选出一种高水平表达的CAR启动子。同时根据人密码子偏好探究了SMN1编码基因密码子优化对表达水平的影响,确定了可以提升SMN蛋白表达的密码子优化序列。组合上述两种优化结果获得了新的SMN蛋白表达载体psc AAV-CAR-co SMN1。本文进一步在新生小鼠和成年小鼠中用静脉注射(IV)和侧脑室注射(ICV)两种途径给药,研究了r AAV9-CAR-EGFP的体内表达分布特性。结果表明,新生鼠ICV注射r AAV9-CAR-EGFP对于脑部和脊髓可以观察到EGFP高转导效率和高强度表达,新生鼠IV注射r AAV9-CAR-EGFP可在脑组织观察到明确的EGFP绿色荧光,表明该病毒可有效穿越血脑屏障,但IV注射对于中枢神经系统的转导效率和表达强度明显低于ICV注射。无论是IV注射还是ICV注射,神经和肌肉系统中的EGFP表达都可观察到持续表达;同时还可以观察EGFP蛋白在外周组织中广泛分布,其中以肝脏、骨骼肌和心肌最为显著。另外,成年鼠IV注射r AAV9-CAR-EGFP可在肝脏观察到EGFP持续表达,而新生鼠IV或ICV注射则肝脏中EGFP的表达会随动物生长而明显衰减。最后,本研究根据r AAV9的体内分布特性,选择侧脑室给药途径,用r AAV9-CA-co SMN1给予SMA I型小鼠治疗干预。结果显示SMA小鼠相比自然病程得到了极显著的改善,中位生存期由10天提升至了50天以上,证明了r AAV9-CA-co SMN1在疾病模型动物的体内有效性。本文在国际上首次使用严重型Taiwanese SMA-like小鼠开展AAV9载体介导的SMN1基因转移治疗研究,而其它研究者在与本研究类似的AAV介导基因治疗中多采用△7 SMA模型。台湾模型比△7 SMA模型的疾病程度更严重。本研究将该型模型小鼠的中位生存期提升了500%以上,证明了r AAV9-CA-co SMN1非常显著的治疗效果,为下一步将该SMA基因治疗药物推向临床奠定了基础。