河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)是我国重要的经济鱼类,具有明显的性别二态性。雄性比雌性生长速度快约30%,可作为研究鱼类性别决定及分化机制的理想模型。性腺生殖功能的维持需要多种基因的表达,而Vasa、Dazl、Nanos1和Dmrt1基因是鱼类原始生殖细胞迁移、分化和性别决定所必不可少的。因此,本研究以河川沙塘鳢为研究对象,利用q RT-PCR、Western-blot、免疫组化等技术对Vasa、Dazl、Nanos1和Dmrt1基因在河川沙塘鳢胚胎和性腺不同发育时期的表达和定位进行系统研究,为该鱼性别决定及分化机制的阐明提供了基础资料。研究结果如下:1.本研究克隆了河川沙塘鳢Vasa、Dazl、Nanos1基因的c DNA全长,Vasa的c DNA全长为2357 bp,包括1944 bp开放阅读框(ORF),编码647个氨基酸,5′和3′UTR区分别为116 bp和297 bp。Dazl基因的c DNA全长为842 bp,其中包括648 bp开放阅读框,编码215个氨基酸,一个117 bp的3′UTR和77 bp的5′UTR。Nanos1基因的c DNA序列全长为1178 bp,包含一个155 bp的5′UTR,一个660 bp的开放阅读框,编码219个氨基酸和一个363 bp的3′UTR。氨基酸序列比对和系统进化树分析发现河川沙塘鳢Vasa、Dazl、Nanos1基因在进化上具有一定的保守性和差异性,但其保守结构域高度保守。组织表达的q RT-PCR结果显示,Vasa和Dazl基因在性腺表达量最高。Nanos1基因在性腺和其他组织中都有表达,但是在脑和性腺中的表达量显著高于其他组织,推测Nanos1参与并调控脑-垂体-性腺轴。2.时序表达的qRT-PCR、Western-blot分析结果均显示Vasa、Dazl、Nanos1在精巢呈现下降的表达趋势,在卵巢Vasa、Dazl、Nanos1蛋白呈下降趋势,而m RNA水平呈现先下降后上升的趋势。免疫组化结果显示Vasa、Dazl、Nanos1在除精细胞和成熟精子外的所有生殖细胞中均有表达,预示着这三个基因可能参与河川沙塘鳢两性配子的发生。Vasa、Dazl和Nanos1在生殖细胞特异性表达,说明Vasa、Dazl和Nanos1蛋白可以用作鉴定河川沙塘鳢性腺中生殖细胞的新标记。河川沙塘鳢Vasa、Dazl、Nanos1基因在卵巢Ⅳ期时的m RNA表达量相对升高,且在胚胎发育原肠胚前保持较高的表达,原肠胚后表达量显著降低或基本检测不到,可见,Vasa、Dazl、Nanos1可能作为母源生殖质成分参与河川沙塘鳢原始生殖细胞的生成和迁移。3.经HCG和LHRH-A2刺激后,与对照组相比不论是低浓度还是高浓度激素刺激下精巢Vasa、Dazl和Nanos1基因表达均下调。在卵巢中,与对照组相比,两种浓度的HCG和0.02μg/g的LHRH-A2刺激下,Vasa和Nanos1的表达量均增高,Dazl无显著差异。然而,激素刺激后Vasa、Dazl和Nanos1蛋白均检测不到表达。预测这3个基因在性腺发育过程中参与HPG轴的调控。4.河川沙塘鳢Dmrt1基因c DNA的全长序列为2025 bp,894 bp的开放阅读框,编码297个氨基酸、73 bp的5′UTR和1058 bp的3′UTR。q RT-PCR结果表明Dmrt1基因在精巢中特异性表达,在精巢不同发育时期呈现先下降后上升的趋势。在胚胎发育不同时期的表达呈先上升后下降的趋势,在原肠胚时期达到最高。而Dmrt1在卵巢各发育时期表达量都很低。