论文部分内容阅读
二肽基肽酶Ⅳ(DPP4)是糖尿病治疗的新靶点,可通过调节其活性来控制餐后血糖的浓度,从而达到防治Ⅱ型糖尿病(T2D)的目的。在近年的研究中,具有DPP4抑制活性的生物活性肽成为人们关注的热点。燕麦、荞麦和青棵是健康食品,传统上认为它对心血管疾病有益,其蛋白质含量很高,但其蛋白多肽的健康作用不甚清楚。本文研究了燕麦、荞麦和青稞蛋白多肽对DPP4的抑制活性：鉴定了燕麦球蛋白多肽的结构特征,计算机模拟筛选出并合成了人工多肽：最后利用Caco-2细胞模型研究了燕麦多肽对细胞内DPP4抑制活性和表达的影响,经及对与T2D相关的靶标α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)、转运蛋白2和5(GLUT2和GLUT5)的影响,主要结论如下：(1)从燕麦中提取球蛋白和谷蛋白,从莽麦中提取清蛋白和谷蛋白和从青稞中提取清蛋白和谷蛋白成分。利用不同水解方式水解脱脂粉和蛋白粉获得的水解物均具有DPP4抑制活性,且均呈现浓度依赖性：体外胃肠道模拟水解燕麦、荞麦和青稞脱脂粉水解后的DPP4抑制活性检测发现燕麦粉的水解物对DPP4抑制活性最强,其IC50值为0.99 mg/mL;胰蛋白酶水解燕麦球蛋白14 h,且分子量(MW)小于3 kDa(MW<3 kDa)的组分(OGb)对DPP4的活性抑制性较强(IC502.04 mg/mL);碱性蛋白酶可在短时间内释放出更多的DPP4抑制肽。(2)利用液质联用(LC-ESI-MS/MS)对OGb进行多肽成分分析,得到了35个多肽,其肽链长度均大于7个氨基酸残基,且N端均含有‘R’或‘K’残基；通过电脑模拟技术筛选出了9个多肽,它们均可以与DPP4活性中心紧密结合,对其中两个结合性最好的多肽LQAFEPLR (LQ8)和EFLLAGNNK (EF9)进行人工合成,发现其对DPP4(来自猪肾脏)抑制活性均呈浓度依赖性,其中,LQ8的抑制活性很高,其IC50为103.5 μM(0.1 mg/mL),而EF9随着浓度的增加对DPP4抑制活性变化缓慢,浓度在400 μg/mL时对DPP4的抑制率仅为30%左右。(3)首次通过Caco-2田胞模型对燕麦多肽的抑制机制进行了较全面的研究。用含有LQ8, OGb和Sitagliptin (STP,阳性对照)的完全培养液分别处理Caco-2细胞,控制细胞培养时间。结果发现48 h培养的Caco-2细胞中DPP4的活性最低,进一步通过Western Blot实验发现这些样品能够减少Caco-2细胞内DPP4的相对表达量,增加肠促胰岛素GLP-1的相对表达量,但同时也促进了其它糖尿病靶标的相对表达量,如α-glucosidase和GLUT2和GLUT5.本研究的结果表明,燕麦蛋白可能是糖尿病防治很好的肽源,值得得深入研究。