【背景】智力迟滞,常染色体显性遗传21（Mental retardation,autosomal dominant 21,MRD21）（OMIM#615502）是CTCF基因变异引起的一种非常罕见的常染色体显性遗传病,主要表现为生长迟缓、智力低下及特殊面容等。身材矮小是该病的主要临床特征之一,但其发病机制并不明确。近年研究表明,CTCF蛋白对调控肢体发育相关基因的时空特异性表达至关重要。例如,CTCF可作为转录调控因子,激活IGF2基因的转录活性,影响儿童生长发育,提示CTCF参与胰岛素样生长因子（IGFs）信号通路的调控。本团队前期在一例矮身材患儿血样中检测出CTCF基因致病性变异（c.1699C>T,p.Arg567Trp）。【目的】本研究拟探讨CTCFR567W基因变异的分子基础及对IGFs信号通路的影响,以期解释MRD21矮身材的致病机制。【方法】1.生物信息学技术分析:在线软件（Con Surf,WEBLOGO,PREDICTSNP等）分析CTCF氨基酸序列的保守性及CTCFR567W变异的致病性。通过构建蛋白三维结构模型分析CTCFR567W变异体的分子结构变化。2.细胞模型构建:采集患者外周血单核细胞构建永生化淋巴细胞系;以p CMV-Flag-N表达质粒为空白质粒,利用同源重组技术构建野生型CTCF表达质粒;同时,以野生型CTCF质粒为模版,采用基因定点诱变技术构建突变型(CTCFR567W)表达质粒。3.实验分组:利用脂质体转染技术将上述质粒分别转染至人胚肾HEK293T细胞系（HEK293T）和人正常肝细胞系（L-O2）,将本实验分为空白组（p CMV）、野生组（CTCF-WT）变异组（CTCF-MUT）三组。4.基因表达水平:采用荧光定量PCR（qPCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和蛋白印迹技术（WB）分析CTCF和IGFs信号通路的关键基因（IGF1、IGF2、IGFBP3、IGF1R）的表达水平。5.CTCF和IGF1、IGF2启动子相互作用分析:应用染色体免疫共沉淀联合qPCR技术（CHIP-qPCR）分析CTCFR567W变异体与IGF1、IGF2基因启动子结合强度。应用荧光素酶报告基因检测体系评估该变异体对IGF1和IGF2基因启动子活性的影响。6.转录组学测序:收集患者来源的LCLs和健康正常人的LCLs,进行高通量RNA转录组测序（RNA-seq）,应用Deseq软件筛选差异表达基因,利用GO数据库和KEGG数据库进行生物学富集分析。【结果】1.p.Arg567在脊椎动物间高度保守。在线软件Dynamut预测氨基酸残基Arg567替换为Trp567降低（ΔΔSVib ENCo M:-4.186 kcal/mol/K）。蛋白的三维分子结构模拟发现Arg567与DC21的氢键作用力丢失,可能影响锌指结构11的局部α螺旋的稳定性和CTCFR567W变异体对DNA的亲和力。2.qPCR结果显示:与野生组相比,CTCFR567W变异的m RNA表达几乎没有改变;变异组中,IGF1、IGF2和IGFBP3基因的m RNA表达显著下降;而IGF1R基因的m RNA表达在两组之间无统计学差异。3.Western Blot结果显示:CTCFR567W变异的蛋白表达在两组之间几乎没有改变。ELISA结果显示:与野生组相比,变异组中,IGF1、IGF2和IGFBP3基因的蛋白表达显著下降。4.CHIP-qPCR结果显示:与野生组相比,CTCFR567W变异体和IGF1、IGF2基因启动子的结合率显著下降。5.荧光素酶实验结果显示:与野生组相比,变异组中,IGF1和IGF2基因启动子的转录活性显著降低。6.RNA测序结果发现多个差异表达基因与IGFs信号通路相关。GO数据库分析显示,差异表达基因富集于DNA特异性结合区域。KEGG数据库分析显示,差异表达基因涉及细胞因子间信号转导机制。【结论】CTCFR567W变异体可导致该蛋白与IGF1、IGF2基因启动子的结合率降低,引起IGF1和IGF2的表达下调,进而导致矮身材的发生。RNA-seq结果提示可能存在其他基因参与CTCF基因变异的致病机制。本研究为CTCF基因变异致矮身材的发病机制提供了新见解,且为探索MRD21矮身材的治疗靶点提供理论依据。