荔浦芋球蛋白的提取纯化及其体外对细胞糖代谢影响作用的研究

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芋头,天南星科草本植物,富含多糖、蛋白质、黄酮和皂苷等多种活性物质。本文提取、分离和纯化荔浦芋球蛋白,测定该球蛋白的相对分子量、纯度、氨基酸组成、等电点和二级结构,并通过α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性,和对IR-Hep G2细胞葡萄糖消耗量、糖原合成量、HK和PK活性以及IRS2、GLUT4、PCK2和G6Pase蛋白质表达的影响研究其体外对糖代谢影响作用,为特定人群的特殊膳食研发提供借鉴。主要研究结果如下:1.采用含0.3 mol/LNa Cl的磷酸缓冲液(0.1 mol/L,p H=6.8)提取荔浦芋球蛋白,优化获得最优提取工艺为:液料比为15 m L/g、提取温度为40℃、提取时间为120 min,此时球蛋白提取率为36.75±0.31%,纯度76.72±0.47%。2.采用80%硫酸铵分离和DEAE-52柱层析法纯化球蛋白,得到五个洗脱峰,其中0.1 mol/L Na Cl洗脱所得的球蛋白含量、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性最高,测得相对分子质量为22 k Da,纯度为93.58±0.29%,氨基酸含量最高的为天冬氨酸、谷氨酸和亮氨酸,等电点为5.6±0.2,二级结构组成为:β-折叠为39.42%~42.61%,无规卷曲为26.34%~31.38%,β-转角为18.25%~24.16%,α-螺旋为5.04%~13.27%。3.通过双倒数曲线法得到球蛋白对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均为非竞争性抑制,对α-淀粉酶的IC50为0.75±0.10 mg/m L,对α-葡萄糖苷酶的IC50为2.09±0.19 mg/m L,根据酶抑制动力学曲线方程计算出其对α-淀粉酶的Ki=11.47±0.57 mg/m L,对α-葡萄糖苷酶的Ki=39.67±1.20 mg/m L,表明该球蛋白具有调节血糖的潜力。4.进一步研究球蛋白对IR-Hep G2细胞葡萄糖消耗量、糖原合成量、HK和PK活性以及IRS2、GLUT4、PCK2和G6Pase蛋白质表达的影响。研究结果:荔浦芋球蛋白可以显著提高IR-Hep G2的葡萄糖消耗量,增长率达40.62±0.98%,有效促进细胞对葡萄糖的吸收;显著提高肝糖原含量,增长率达28.80±1.26%;显著提高HK和PK活性,增长率依次为54.63±2.48%和44.29±2.64%。WB实验测定的相关蛋白质的表达规律性不明显,选取PI3K/Akt信号通路中的信号元的蛋白表达初步显示一定规律性,但不足以解释机理,应选取更多相关信号通路中特有的关键酶加以辅证,以确定信号通路。综上,球蛋白能改善Hep G2细胞胰岛素抵抗,能促进葡萄糖吸收和肝糖原的生成,增强糖酵解相关酶活性。5.测定了荔浦芋球蛋白的加工特性,为其应用于血糖调节功能食品奠定基础。研究结果:球蛋白的溶解性在65℃最大,在等电点附近最小,且碱性条件下更高,持水性在50℃最大,p H4.5~6.0时持水性最差,持油性在50℃达到最小,起泡性与溶解性的规律相似,而起泡稳定性在等电点最高,乳化性和乳化稳定性在等电点处最低而碱性条件下偏高,DSC分析得到球蛋白变性温度为79.30±1.36℃,焓值为7.46±0.53 J/g。
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