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众所周知糖尿病患者常伴有糖代谢功能障碍,而糖代谢功能障碍可诱发各器官组织发生微血管改变。糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是目前发达国家成人致盲的主要原因之一,也是糖尿病患者最严重的微血管并发症之一。高糖诱发视网膜发生各种应激反应,激活细胞凋亡三大通路,最终经线粒体、死亡受体和内质网,导致视网膜细胞和神经元细胞凋亡,加剧胶质细胞增生,引起视功能下降。线粒体通路被称为凋亡的“调节中枢”,是最主要的凋亡通路。很多胞外信息,如高葡萄糖,在激活胞内通路的同时会过度消耗或失活胞内的还原性物质或酶类,引起线粒体呼吸链中活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)产生增多,激活氧化应激,导致细胞凋亡。p66Shc蛋白可以感受细胞内ROS浓度的改变,增加细胞的凋亡,调节细胞寿命。既往研究证实p66Shc可介导糖尿病诱导的氧化应激及氧化应激依赖的肾脏损伤。糖尿病视网膜病变与糖尿病肾病类似,两者具有共同的发病机制。但p66Shc蛋白在糖尿病视网膜病变中的作用和机制研究并无很多相关文献报道。我们推测p66Shc可能在糖尿病视网膜病变发生发展中有重要作用。本研究拟分别通过体内及体外实验,观察高糖条件下p66Shc及磷酸化p66Shc的表达变化及其与氧化损伤及细胞凋亡的关系,从器官、细胞、分子等水平证实我们的假设,进而提出改善高糖条件下视网膜氧化应激的新途径,减少视网膜细胞的凋亡,为糖尿病视网膜病变的防治提供新的思路。第一部分糖尿病大鼠视网膜内p66Shc的表达目的:p66Shc定位在线粒体,主要与线粒体内活性氧的产生和细胞凋亡有关。根据既往研究结果,我们推测p66Shc在视网膜内有表达,并影响糖尿病视网膜病变的发生发展。本研究旨在探讨链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠视网膜中p66Shc的表达,从一种新的途径出发,更好的研究糖尿病视网膜病变的发病机制。方法:根据糖尿病发生时间长短,将大鼠分为3组:15只D4W大鼠(糖尿病发病后4周),15只D12W大鼠(糖尿病发病后12周)和15只非糖尿病对照组。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测SD大鼠视网膜内p66Shc mRNA和蛋白的表达情况。免疫组织化学染色法检测大鼠视网膜p66Shc的表达部位。TUNEL法检测凋亡细胞数。结果:正常大鼠和糖尿病大鼠视网膜内均可见p66Shc表达,p66Shc mRNA和p66Shc蛋白表达水平均随着糖尿病病程的进展而增加。p66Shc表达主要集中在视网膜神经节细胞层和内核层。与正常对照组相比,D12W组视网膜细胞凋亡率明显升高。结论:p66Shc主要集中在大鼠视网膜神经节细胞层和内核层。随着糖尿病病程的发展,p66Shc表达逐渐增加,凋亡细胞数也增加。第二部分高葡萄糖条件下R28细胞内p66Shc的表达变化目的:本部分研究旨在探讨R28细胞在高葡萄糖条件下p66Shc蛋白及磷酸化p66Shc蛋白的表达变化。方法:不同浓度D-葡萄糖(5.5mM,15mM,30mM,45mM)干预培养R28细胞12小时后提取细胞RNA和蛋白。同时分别使用30mM D-葡萄糖和30mM D-甘露醇干预培养R28细胞,在各个时间点分别提取细胞RNA和蛋白,观察p66Shc mRNA,p66Shc、磷酸化p66Shc Ser36蛋白的表达变化。结果:随着葡萄糖浓度的增加,p66Shc mRNA表达和p66Shc蛋白表达均逐渐增加。30mM葡萄糖培养R28细胞,随着作用时间的延长,p66Shc mRNA、p66Shc蛋白和磷酸化p66Shc Ser36表达均逐渐增高。相反,在30mM D-甘露醇组(等渗对照组),随着作用时间的延长,p66ShcmRNA、p66Shc蛋白和磷酸化p66Shc Ser36表达均无明显变化。结论:在高葡萄糖条件下,随着葡萄糖浓度的增加,或作用时间的延长,R28细胞内p66Shc表达增加。高葡萄糖诱导p66Shc发生磷酸化。第三部分高葡萄糖条件下p66Shc 在R28细胞氧化损伤中的作用目的:本部分研究旨在探讨观察高葡萄糖条件下,R28细胞氧化损伤和细胞凋亡过程中p66Shc的作用。方法:常规培养R28细胞,分为五组:(1)正常对照组(未转染的R28细胞+5.5mM D-葡萄糖);(2)高糖组(未转染的R28细胞+30mM D-葡萄糖):(3)高糖过表达p66Shc组(转染质粒p66Shc的R28细胞+30mM D-葡萄糖);(4)高糖p66Shc沉默组(小干扰RNA沉默p66Shc表达的R28细胞+30mM D-葡萄糖);(5)高糖S36A 突变组(转染 pcDNA3.1 his p66Shc S36A 的 R28 细胞+30mM D-葡萄糖)。MitoSox Red方法检测线粒体ROS含量,激光共聚焦显微镜检测膜电位水平;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测胞浆内半胱天冬酶9(caspase9)蛋白质、线粒体内p66Shc和细胞色素C的表达;提取线粒体DNA,PCR检测线粒体DNA的损伤。结果:在高葡萄糖条件下,随着R28细胞线粒体内p66Shc蛋白水平的升高,线粒体内ROS含量也升高,线粒体膜电位下降,线粒体DNA损伤加重,线粒体内细胞色素C含量减少,胞浆内半胱天冬酶-9(caspase9)蛋白表达下降,细胞凋亡增加。相反,与高糖组比较,高糖p66Shc沉默组和高糖S36A突变组线粒体内p66Shc蛋白水平下降,ROS产生减少,线粒体膜电位部位恢复,线粒体DNA损伤减轻,线粒体内细胞色素C含量增加,胞浆内半胱天冬酶-9蛋白表达部分恢复,细胞凋亡减少。结论:在高葡萄糖条件下,p66Shc通过线粒体途径导致R28细胞发生氧化损伤和细胞凋亡。p66Shc过表达进一步加重R28细胞氧化损伤和细胞凋亡。相反p66Shc沉默或p66Shc第36位丝氨酸突变会降低R28细胞的氧化损伤和细胞凋亡。