常温常压等离子诱变技术(ARTP)诱变斑马鱼性状筛选及基因分析

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鱼类养殖在我国水产养殖中占有很大的比重,为了获得具有优良性状的个体,鱼类诱变育种技术逐渐受到广大学者的关注。诱变育种一般是采用物理或者化学的方法引起鱼类DNA损伤,从而产生可遗传变异,在相对较短的时间内获得具有优良性状的育种方法。但传统的诱变方法具有安全性较差,诱变频率低等弊端,因此寻找一种具有安全高效等特点的诱变手段是十分必要的。本篇论文将斑马鱼作为主要的研究对象,将野生型斑马鱼作为实验亲本,对其进行体外人工授精操作,对所获得的受精卵进行诱变处理,主要处理方法为:在受精卵发育到Ⅰ细胞期时对其进行ARTP处理,设置处理时间为:90、180、270、360、450、540、630和720 s。随后对处理后的受精卵进行受精率、白卵率、孵化率、畸形率等相应指标的统计。F1代培养3个月后与野生型进行交配,对所产的F2代进行性状筛选,并且对具有特殊性状的F2代进行全基因组重测序,对突变基因进行相应的分析。(1)经过ARTP对斑马鱼胚胎进行处理后统计其受精率、白卵率、孵化率以及畸形率后发现,ARTP主要对斑马鱼胚胎的受精率产生较大影响,经过对实验结果统计后发现,野生空白对照组的受精率可达85%~100%,不同时间处理组的受精率均低于野生空白对照组,受精率约为38%~82%,该实验结果说明ARTP对斑马鱼胚胎的受精过程具有一定的阻滞作用。对斑马鱼胚胎经行较长时间的ARTP处理其白卵率,会出现一定程度的升高,其空白对照组白卵率约为4%~11%,实验组约为6%~32%,证明ARTP确实会影响斑马鱼胚胎的正常发育,导致斑马鱼胚胎在发育8~24 h内出现发育停止甚至死亡,最终导致白卵的出现。除上述结果外,ARTP诱变还可能造成斑马鱼胚胎发育情况异常,严重时会导致斑马鱼胚胎的孵化率下降,畸形率升高。(2)为了进一步筛选出突变型斑马鱼,将经过诱变处理后的受精卵进行人工孵化,等待斑马鱼胚胎发育至3~5月后进行杂交实验,结果发现720 s处理组中存在精子活性降低的突变型斑马鱼,野生型斑马鱼雄鱼正常交配后受精率约为87%~99%,而突变型斑马鱼正常交配后受精率均为10%以下,其结果具有差异性(P≤0.001)。(3)将实验组的受精卵进行常规培养,等到其发育至性成熟后进行杂交实验,在其所产生的子代中进行筛选,经过大量的杂交实验后得到两种突变性状,即心腔畸形与下颌骨发育异常。心腔畸形的斑马鱼仔鱼在体视显微镜下可以明显观察到其心腔部位膨大,为了进一步确定突变型斑马鱼心腔异常程度,进行组织学切片染色,通过对结果进行分析后发现,突变型斑马鱼心室心房分化不明显,并且有心腔积水的情况。正常的野生型斑马鱼仔鱼在受精后6 dpf鱼鳔充气,开始平游并进行摄食。但下颌骨突变型斑马鱼仔鱼即使在受精后7 dpf,鱼鳔仍然无法充气,不能平游,无法进行摄食,并且随着时间的延长出现死亡。在体视显微镜下进行观察后发现正常斑马鱼仔鱼的下颚前端突出于头部,而下颌骨发育异常的斑马鱼仔鱼下颚前端短于头部。为了进一步明确性状差异,对其进行阿尔新蓝染色,结果发现突变型斑马鱼下颌骨中的麦克氏软骨缺失,角舌软骨内陷,角鳃骨无法扩张。(4)选择进行ARTP处理后精子活力下降的突变型雄性斑马鱼三尾与野生型雄性斑马鱼三尾进行全基因组重测序后发现,ARTP可以有效提高生物体突变效率,具体提高的突变类型主要有外显子中单核苷酸序列突变个数、外显子中使基因获得终止密码子的变异个数、外显子中同义突变个数、外显子中缺失导致蛋白质编码框改变突变个数、位于外显子区域发生拷贝数变异个数、位于内含子区域发生拷贝数变异个数、拷贝数增加个数、拷贝数增加长度等。
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