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目前水产养殖中常用益生菌制剂的菌种多数筛选自畜禽动物肠道或者其生存环境中,这类益生菌在鱼类肠道中的粘附定植效果较差,导致它们对鱼类的益生作用并不理想。因此,从鱼类肠道中筛选鱼源益生菌是解决这一问题的主要途径之一。本研究以吉林省特色经济鱼类洛氏鱥Rhynchocypris lagowskii(Dybowski,1869)为研究对象,从其肠道分离筛选具有产蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能力的益生菌,通过产酶能力检测、体外抑菌试验及对抗生素敏感性试验筛选出产酶能力强的细菌,进一步通过检测细菌的耐高温能力、耐酸性能力、耐胃液能力、耐肠液能力、耐胆盐能力及菌株安全性对细菌益生特性作出评价,并通过体外粘附模型研究了潜在益生菌的粘附能力和粘附机制。相关试验结果如下:试验一:本试验共从健康洛氏鱥肠道分离出214株细菌,其中具有:产蛋白酶能力的细菌86株,占40.19%;产淀粉酶的细菌53株,占24.77%;产脂肪酶的细菌47株,占21.96%;能同时产三种酶的细菌28株,占13.08%。采用琼脂打孔扩散法测定了15株产酶能力较强的细菌分别对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、大肠杆菌(Escherichia coli)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、爱德华氏菌(Edwardsiella)和温和气单胞菌(Aeromonas sobria)等常见病原菌的拮抗能力。然后根据拮抗试验结果筛选出10株拮抗能力较强的细菌,进一步采用纸片法测定这10株细菌对17种抗生素的敏感性。最终筛选出8株产酶能力和拮抗病原菌能力较强,且携带耐药因子较少的细菌作为潜在益生菌,分别命名为LSG1-1、LSG2-1、LSG2-3-2、LSG2-5、LSG2-8、LSG3-3、LSG3-7和LSG3-8。试验二:结合细菌形态学、生理生化特征和16S r RNA序列分析对8株潜在益生菌进行鉴定,结果显示菌株LSG1-1、LSG2-1、LSG2-3-2、LSG2-5、LSG2-8、LSG3-3、LSG3-7和LSG3-8分别与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subt ilis)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezen sis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)、阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)和莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)具有最高的相似性。构建系统发育树进一步分析后最终鉴定8株细菌分别为地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌和莫海威芽孢杆菌。试验三:体外模拟鱼类肠道消化环境检测细菌的益生特性。通过细菌的耐高温试验、耐酸性试验、耐胆盐试验、耐胃液试验、耐肠液试验和安全性检测试验对细菌的益生特性作出评价。试验结果显示:各菌株均具有良好的耐受性。其中LSG2-1和LSG2-8对高温的耐受能力显著高于其它菌株(P<0.05),而LSG2-3-2和LSG3-6对高温的耐受能力显著较低(P<0.05);LSG3-7耐酸能力显著较高(P<0.05),LSG2-5耐酸能力显著较低(P<0.05);LSG3-7对胃液的耐受能力显著较高(P<0.05),LSG2-1和LSG3-8对胃液的耐受能力显著较低(P<0.05);LSG2-5对肠液耐受能力较高(P<0.05),LSG3-8的对肠液的耐受能力显著较低(P<0.05);LSG3-6对胆盐的耐受能力较高(P<0.05),LSG2-3-2对胆盐的耐受能力显著较低(P<0.05)。菌株的安全性试验结果表明各菌株对洛氏鱥均有很好的安全性。试验四:采用洛氏鱥的肠道黏液蛋白建立体外肠道黏液蛋白模型,结合荧光标记物hoechst3325标记细菌法,检测了8株潜在益生菌对洛氏鱥肠道黏液蛋白的粘附能力。试验结果显示:LSG1-1的粘附率为10%,LSG2-1的粘附率为16%,LSG2-3-2粘附率为18%,LSG2-5粘附率为35%,LSG2-8粘附率为36%,LSG3-6粘附率为24%,LSG3-7粘附率为34%,LSG3-8粘附率为33%。再以高碘酸钠、蛋白酶K和胰蛋白酶分别修饰各细菌及洛氏鱥肠道黏液蛋白,分析各细菌表面凝集素和肠道黏液蛋白上粘附受体的主要性质,结果显示:LSG1-1、LSG2-1、LSG2-5、LSG2-8、LSG3-6和LSG3-7细胞表面凝结素主要表现出的是糖蛋白性质,而LSG2-3-2和LSG3-8菌株细胞表面的凝结素主要表现出蛋白质性质;LSG1-1、LSG2-3-2、LSG2-5、LSG2-8和LSG3-6在黏液蛋白中的粘附受体为蛋白质类物质,而LSG2-1、LSG3-7和LSG3-8在黏液蛋白中的粘附受体为糖蛋白类物质。最后分别采用排斥、竞争和取代试验研究了8株潜在益生菌对嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌2株病原菌的粘附抑制作用。结果显示:竞争试验中LSG2-5、LSG2-8和LSG3-6对嗜水气单胞菌的粘附抑制力显著高于其它菌株(P<0.05),而LSG1-1和LSG2-1对维氏气单胞菌的粘附抑制力显著高于其它菌株(P<0.05);排斥试验中LSG2-5、LSG2-8和LSG3-6对嗜水气单胞菌的粘附抑制力显著高于其它菌株(P<0.05),LSG3-8和LSG2-8对维氏气单胞菌的粘附抑制力显著高于其它菌株(P<0.05);取代试验中LSG2-5、LSG2-8和LSG3-6对嗜水气单胞菌的粘附抑制力显著高于其它菌株(P<0.05),LSG3-7和LSG2-8对维氏气单胞菌的粘附抑制力显著高于其它菌株(P<0.05)。试验最终筛选出8株洛氏鱥源芽孢杆菌,均具有良好的益生特性。其中LSG3-3特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)、LSG3-7阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)、LSG3-8莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)均是首次在鱼体内筛选出来,具有良好的应用前景。本研究为洛氏鱥益生菌制剂的研发与应用提供了菌株参考和科学依据。