脂肪肝是围产期奶牛高发的一个重要营养代谢性疾病,降低奶牛的生产性能。由于奶牛产后干物质采食量（DMI）降低,而泌乳能量需求增加,致使奶牛机体进入能量负平衡状态,而为了满足妊娠和泌乳的能量需求而动员脂肪导致大量非酯化脂肪酸（NEFAs）进入血液,形成高NEFA血症。大量NEFA进入肝脏后酯化形成甘油三酯（TG）,进而导致脂肪肝的产生。血浆NEFA,脂肪肝和脂质过氧化之间的联系均与代谢应激有关。细胞内Ca²⁺的稳态是细胞保持正常结构和功能的前提与基础。钙池引发的钙离子进入（SOCE）是非兴奋性细胞调控其细胞内钙离子浓度Ca²⁺的主要通道。Orai1是SOCE在细胞膜上的孔蛋白。本研究团队前期发现Orai1调控围产期奶牛高NEFA引起的肝脂肪从头合成通路,进而形成脂肪肝。而Orai1是否通过代谢应激引起肝脂沉积尚不明确。因此,本研究旨在明确高NEFA在肝脂沉积过程中是如何调控氧化应激与内质网应激。本研究利用高NEFA刺激原代犊牛肝细胞构建的肝脂沉积模型进行研究。首先原代犊牛肝细胞经1.2 mM NEFA分别刺激0.5、1、3、6、9、12 h。结果发现,NEFA在0.5 h时可显著增加肝细胞中Orai1的表达含量并且1 h时显著增加Ca²⁺浓度,氧化应激相关指标还原型谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）在1 h极显著降低,丙二醛（MDA）和过氧化氢（H₂O₂）在1 h极显著升高。内质网应激相关分子PERK、IRE1、GRP78、ATF6、CHOP在6 h显著增加。结果表明,NEFA激活Orai1表达、增加胞内Ca²⁺浓度,并促进氧化应激与内质网应激。随后在肝细胞中添加氧化应激抑制剂NAC 2 h后,再加入NEFA刺激6 h,结果显示,NAC阻断了由NEFA引起的Orai1以及主要的ER应激蛋白的表达。表明氧化应激可引起内质网应激的产生,降低氧化应激可缓解内质网应激。为了研究Orai1在氧化应激、线粒体功能障碍以及内质网应激中的作用。在肝细胞中加入1.2 mM NEFA处理6 h,结果显示NEFA可上调Orai1表达,以及线粒体损伤相关分子VDAC1,CLPP,CypD丰度。NEFA诱导线粒体通透性过渡孔（mPTP）的瞬时开放并增加了线粒体膜电位。这些变化与线粒体形态的改变高度相关。此外,NEFA诱导氧化应激相关指标GSH和SOD的降低,MDA、H₂O₂和ROS的升高,增加内质网应激相关分子PERK、IRE1、GRP78、ATF6和CHOP的表达。随后分别对犊牛肝细胞进行沉默或抑制Orai1,SOCE激活剂毒胡萝卜素（Thapsigargin）或钙离子载体离子霉素（Ionomycin）的刺激,以确定ORAI调节。当沉默或抑制Orai1 12 h后,添加NEFA刺激6 h,结果发现,Orai1的沉默或抑制可消除氧化应激,包括增加的GSH和SOD含量,减少MDA和H₂O₂含量以及减少的ROS产生。ER应激蛋白的丰度被下调,线粒体功能得以恢复。此外,Thapsigargin或Ionomycin诱导的线粒体功能障碍并导致Orai1表达增加。结果表明,Orai1可以调控氧化应激、线粒体功能障碍以及内质网应激,NEFA可激活Orai1的表达,随后诱导线粒体功能障碍、氧化应激以及内质网应激的发生。综上所述,能量负平衡诱导的高浓度NEFA刺激肝细胞,通过Ca²⁺的信号转导和Orai1激活氧化应激以及线粒体损伤进而导致内质网应激。