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支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb),革兰氏阴性、需氧的球杆菌,感染可引发犬传染性气管支气管炎和兔波氏杆菌病,也是引起猪传染性萎缩性鼻炎的重要致病因子之一。Hfq参与调节细菌的多种生命活动,绿脓杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、布氏杆菌、霍乱弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌,脑膜炎奈瑟菌等hfq缺失后,细菌对小鼠的毒力明显减弱,对细胞的侵袭能力降低;同时针对其构建突变株,可获得减毒新型疫苗株。Hfq对支气管败血波氏杆菌的调节作用尚不清楚。因此,进行支气管败血波氏杆菌Δhfq突变株研究,明确Hfq的调节作用,可揭示支气管败血波氏杆菌的致病机制,也可为研究其减毒新型疫苗提供可能性。采用正向筛选同源重组技术,PCR扩增Bb122株hfq两端侧翼序列,将其克隆至质粒pBC-SK相应的酶切位点,构建自杀性质粒pBC-hfq;克隆卡那霉素抗性基因表达盒至hfq两端侧翼序列之间,构建重组转移质粒pBC-Δhfq。将pBC-Δhfq电转化至Bb122感受态细胞中。在抗性培养基上进行筛选,通过对卡那霉素抗性基因表达盒进行PCR和测序验证、对缺失的hfq进行PCR验证,表明卡那霉素抗性基因表达盒已经插入至hfq两端侧翼序列之间,hfq已经缺失完全,证明成功构建了支气管败血波氏杆菌Δhfq突变株。连续传20代,具有良好的遗传稳定性。体外生长曲线表明:在37℃培养时,Δhfq突变株在1~6 h生长速度基本和亲本菌株Bb122一致,6 h后生长速度略快于亲本菌株。进行抗逆性试验,在紫外线照射(UV)和50℃条件下,Δhfq突变株的耐受能力分别显著低于亲本菌株(p<0.05);在H2O2条件下,Δhfq突变株与亲本菌株均无耐受能力。粘附和侵袭试验表明Δhfq突变株的粘附、侵袭能力低于亲本菌株,差异不显著。Δhfq突变株与亲本菌株分别对小鼠进行腹腔接种,Δhfq突变株以2.0×109 cfu剂量接种时,5只小鼠全部存活;亲本菌株以2.0×109 cfu剂量接种时,5只小鼠全部死亡,说明Δhfq突变株对小鼠的致病性是减弱的。小鼠免疫攻毒试验表明Δhfq突变株以2.0×109 cfu剂量免疫两次后,可耐受2.0×109 cfu剂量亲本菌株的攻击,说明Δhfq突变株具有良好的免疫原性。本研究构建了支气管败血波氏杆菌Δhfq突变株。Δhfq突变株具有良好的遗传稳定性和生长能力;Δhfq突变株对小鼠的毒力显著降低,初步明确hfq是与支气管败血波氏杆菌毒力相关的基因。Δhfq突变株具有良好的免疫原性,可为研究其减毒新型疫苗提供可能性,也可为Bb致病机制的研究奠定基础。