月季A类花器官发育基因的克隆与功能分析

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月季(Rosa sp.)是中国的传统名花,也是世界重要观赏花卉。现代月季遗传背景复杂,是由蔷薇属的多个种反复杂交回交选育而来。大多数的野生蔷薇属植物只有单轮五枚花瓣,但在长期栽培选育中月季的花瓣数量发生变化,产生了丰富多样的花型。目前,月季的花发育模型研究尚不完善,重瓣花形成的分子机理还不清晰。本研究拟采用RT-PCR结合RACE技术从中国古老月季’月月红’(Rosa chinensis ’Semperflorens’)中克隆与花器官发育相关的A类基因,通过瞬时转化烟草表皮细胞对其进行蛋白亚细胞定位,利用实时荧光定量PCR技术探究2个基因的时空表达模式及组织特异性表达规律,然后利用花器官侵染法转化野生型拟南芥对月季A类基因进行功能验证。主要试验结论如下:(1)获得RcAP1和RcAP2的cDNA全长及RcAP2所在的DNA全长。RcAP1开放阅读框(ORF)为 744 bp,编码247个氨基酸;RcAP2 cDNA全长 2236 bp,开放阅读框为1608 bp,5’端非编码区为365 bp,3’端非编码区长263 bp,编码535个氨基酸。RcAP2的DNA序列由10个外显子和9个内含子组成。(2)构建RcAP1和RcAP2的植物表达载体,亚细胞定位试验表明,2个蛋白均主要在核内产生荧光,符合其转录因子的蛋白定位特性。(3)在花芽分化初期,RcAP1和RcAP2均上调表达,在整个花发育过程中,小蕾期的表达量最高。在花发育的中后期具有组织特异性表达的特点,RcAP1仅在萼片中表达,RcAP2主要在萼片、花瓣中表达,并在花瓣中表达量最高。在雄蕊瓣化程度不同的花瓣中,RcAP2在最外轮花瓣中表达量最高。随着月季品种的重瓣性增强,RcAP2的表达量随之升高。(4)通过对过表达RcAP1和RcAP2基因的野生型拟南芥的表型分析发现,转RcAP1拟南芥株系植株出现提前开花、花序转变、花瓣数目增多和雄蕊数目减少等表型变化;转RcAP2拟南芥株系的雄蕊数目及形态发生变化,具体表现为雄蕊数目减少,原着生花药的部位出现扁平状的变异,形成类似雄蕊到花瓣的过渡状态。结合基因表达模式分析及转基因的试验结果,本研究认为RcAP1具有使花序分生组织向花分生组织转变、调控萼片发育的功能;RcAP2具有参与花分生组织特性建立、确定萼片和花瓣特性等功能。RcAP1和RcAP2均可能参与调控C类基因的时空表达活性,进而与月季的雄蕊瓣化相关。本研究对月季A类花器官发育基因进行了克隆及功能分析,进一步补充了月季的花发育模型研究和重瓣性分子机制研究,为月季花型分子育种奠定了理论基础。
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