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番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV)隶属于布尼亚病毒科(Bunuyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus), Tospovirus是Bunuyaviridae中唯一一个可以侵染植物的属。TSWV广泛分布于世界各地,可侵染100多个科1000多种植物,常造成严重的经济损失,但在我国报道很少。近年来,随着其主要传毒介体——西花蓟马(Frankliniella occidentalis)的传播和扩散,我们发现TSWV也在逐渐蔓延扩散,分布范围日益扩大,寄主种类也在不断增加,加之TSWV难以防治,对农业生产构成了越来越严重的威胁。为了探究TSWV的扩散蔓延趋势,建立有效的TSWV防治方法,从2009～2013年,作者从云南等地采集了18份样本,分离纯化了部分TSWV株系,并对其进行了进化分析；利用RNAi,成功构建了不同片段长度的反向重复dsRNA植物表达载体,转化烟草后获得了转基因植株；并对表达TSWV dsRNA的转基因烟草的抗病性进行了初步的研究与分析。本研究的主要内容和结果如下：1.番茄斑萎病毒的分离及鉴定首次从鸢尾和豇豆上分离得到TSWV。本文对采自不同地区疑似TSWV症状的样品进行了分离鉴定。从采自云南农业大学校园内的鸢尾叶片上,分离得到病原物,通过寄主症状鉴定,ELISA检测和进一步的分子生物学鉴定,确定该分离物为TSWV分离物,命名为YN-2。克隆了YN-2N基因和GN/GC基因的全长序列,经测序,YN-2N基因全长777bp (GenBank登录号：KC294570),编码258个氨基酸,GN/GC基因全长3408bp(GenBank登录号：KC294569),编码1135个氨基酸。经过与GenBank所登录的其他株系比对后,结果显示,YN-2与来自云南的番茄上(YN01)分离的TSWV的相似性最高：YN-2N基因和GN/GC基因与其相似性分别高达99.74%和99.53%；但在同源进化树分析中,TSWV N基因和GN/GC基因处于不同的分组中,由此我们推断编码GN/GC基因的MRNA与编码N基因的SRNA之间可能发生了基因重配。另外,还从云南不同地区采集的番茄、辣椒和豇豆上分离得到了8个TSWV分离物,并对8个分离物的N基因和GN/GC基因进行了克隆与分析。8个分离物的N基因全长均为777bp,均编码258个氨基酸；GN/GC基因全长均为3408bp,均编码1135个氨基酸。8个分离物的N基因和GN/GC基因与GenBank中登录的中国的其他株系的N基因和GN/GC基因进行相似性比对后,结果显示,8个分离物的N基因和GN/GC基因与中国的其他株系的N基因和GN/GC基因相似性分别高达99.34%和99.38%。通过同源进化树分析发现,8个分离物虽然源自不同的寄主植物,但其起源是一致的。2.转TSWV N基因dsRNA载体烟草及其抗病性研究本研究将利用RNAi成功构建的2个不同片段长度的TSWV N基因dsRNA植物表达载体(±313-1304载体和±536-1304载体,简称313载体和536载体)通过农杆菌介导法转化烟草。并获得转313载体的三生烟阳性植株60株,转356载体的三生烟阳性植株79株,对To代和T1代转基因烟草进行了攻毒试验,攻毒试验结果表明：转536载体的T0代和T1代烟草植株的抗病效果均优于转313载体的T0代和T1代烟草植株的抗病效果；两种类型的转基因阳性植株T0代的抗病效果明显优于T1代的抗病效果。3. TSWV GN/GC基因dsRNA载体构建及其在烟草中的表达利用RNAi,成功构建了4个TSWV GN/GC基因不同区域及不同片段长度的反向重复dsRNA植物表达载体。根据TSWV GN/GC全长基因序列,设计含有限制性内切酶酶切位点(SwaI,AscI,SpeI,BamHI)的引物,扩增含有酶切位点的长度分别为297bp、500bp、328bp和503bp的目的片段,用于构建反向重复dsRNA植物表达载体。以最成熟的dsRNA载体pFGC1008为构建dsRNA的中间载体,其内含子是GUS基因的一段长为335bp的序列,反向重复dsRNA的植物表达载体为pCAMBIA1304,经PCR筛选、酶切和测序等方法进行验证,均表明已经成功的构建了重组载体,并且与预期相同。将构建好的4个dsRNA植物表达载体通过农杆菌介导的方法转化烟草,目前已获得转G13-1304三生烟阳性植株20株,转G15-1304三生烟阳性植株20株,转G23-1304三生烟阳性植株15株,转G25-1304三生烟阳性植株16株。对转基因烟草的抗病性评价需要进一步的研究与分析。