【摘 要】
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克氏原螯虾是我国重要的经济养殖虾品种之一,开展克氏原螯虾免疫与发育调控机理研究对于提高其抗逆能力和养殖产量及新品种选育具有重要的理论与实践意义。YPEL蛋白是一种在真核生物中具有高度保守性的锌指结合蛋白,广泛参与多种细胞的生理过程,但其在甲壳类动物先天免疫反应中的功能尚不明确。本实验克隆了YPEL蛋白家族中的Yippee-2和Yippee-5两个基因,并探讨了它们对克氏原螯虾先天免疫反应的影响,取
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克氏原螯虾是我国重要的经济养殖虾品种之一,开展克氏原螯虾免疫与发育调控机理研究对于提高其抗逆能力和养殖产量及新品种选育具有重要的理论与实践意义。YPEL蛋白是一种在真核生物中具有高度保守性的锌指结合蛋白,广泛参与多种细胞的生理过程,但其在甲壳类动物先天免疫反应中的功能尚不明确。本实验克隆了YPEL蛋白家族中的Yippee-2和Yippee-5两个基因,并探讨了它们对克氏原螯虾先天免疫反应的影响,取得的结果如下:1、在克氏原螯虾中分别克隆获得了长为345 bp和360 bp的Yippee-2和Yippee-5基因的开放阅读框（ORF,open reading frame）。Yippee-2基因编码114个氨基酸,预测蛋白分子量为13 k Da,而Yippee-5基因编码119个氨基酸,预测蛋白大小为14 k Da。Yippee-2和Yippee-5蛋白都具有一个保守的Yippee-Mis18结构域。多重序列比对和进化树分析表明Yippee-2和Yippee-5蛋白在真核生物中都具有氨基酸序列的高度保守性,其中,Yippee-2与福寿螺的相似度达95%,Yippee-5与美国白对虾的相似度达84%。2、分别构建了pGEX4T-1-Yippee-2和PET-32a-Yippee-5重组表达质粒,并用不同浓度的IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blot结果分析表明Yippee-2和Yippee-5重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。利用GST亲和层析柱纯化获得了Yippee-2重组蛋白,利用Ni-NTA亲和层析柱纯化获得了Yippee-5重组蛋白。3、通过Far western blot证实了Yippee-2蛋白与Yippee-5蛋白可发生相互作用。4、通过荧光定量PCR检测Yippee-2和Yippee-5基因在不同组织的分布情况。结果表明Yippee-2和Yippee-5基因在血淋巴细胞、肝胰腺、胃、心脏、鳃、肠和肌肉中均有表达,其中Yippee-2基因在心脏中表达量最高,而Yippee-5基因在血细胞中的表达量最高。5、LPS和poly（I:C）刺激后,Yippee-2和Yippee-5基因的m RNA水平在肝胰腺、肠、肌肉和鳃中的表达模式均具有显著的变化。不同刺激条件下,Yippee-2和Yippee-5基因表达水平均在鳃组织中变化最大。相对于poly（I:C）处理,Yippee-2和Yippee-5基因对LPS的刺激反应更为灵敏。6、Yippee-2和Yippee-5基因RNA干扰后,在鳃、肌肉和肝胰腺组织中Bax、Cyto C、p53、Caspase-3、ATF2、Crustin、ALF和Cactus等细胞凋亡及免疫基因的表达水平均受到显著影响,表明它们可能参与了p53和Toll信号通路的调节。
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