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草莓镶脉病毒（strawberry vein banding virus,SVBV）是一种双链DNA病毒,属于花椰菜花叶病毒属（Caulimovirus）,是侵染栽培草莓的主要病毒。前人研究已证明SVBV P6蛋白是一个多功能蛋白,与SVBV的致病和侵染密切相关。实验室前期以SVBV P6为诱饵蛋白筛选感染SVBV的森林草莓（Fragaria vesca）的酵母cDNA文库,发现一个具有锌指结构的蛋白筛选丰度最高,称之为FvZFP蛋白。为探究FvZFP蛋白的功能以及FvZFP蛋白在SVBV侵染过程中发挥的功能,本研究对FvZFP蛋白进行深入研究。LCI试验证明P6与FvZFP能够在体内互作。进一步研究发现,FvZFP蛋白具有E3泛素连接酶活性,FvZFP蛋白能够将P6蛋白作为泛素连接底物,泛素化降解P6蛋白。遗传转化FvZFP基因,获得超表达FvZFP基因的转基因本氏烟株系。转基因本氏烟能够抑制P6诱导的PGR106-P6的侵染,延缓P6诱导的症状发生。将TRV（tobacco rattle virus）作为表达系统,构建TRV-FvZFP,在森林草莓中超表达FvZFP基因,发现FvZFP基因超表达的森林草莓株系能够显著抑制SVBV侵染,延缓SVBV的症状发生。此外,FvZFP还具有DNA结合功能。凝胶阻滞试验证明,FvZFP能够结合SVBV 35S启动子。构建SVBV 35S-GFP,与FvZFP共浸润本氏烟,发现FvZFP能够显著抑制SVBV 35S启动活性,降低GFP表达。本研究表明,森林草莓锌指蛋白能够在蛋白水平利用泛素化途径抑制SVBV侵染,还能够影响病毒启动子活性,可能会造成SVBV积累受影响。本研究为深入研究SVBV病毒的复制和侵染以及寄主对SVBV的抗病性提供思路,为植物抗DNA病毒研究奠定了理论基础。1.FvZFP蛋白具有E3泛素连接酶活性利用LCI互作系统,构建nLUC-P6和cLUC-FvZFP,共浸润本氏烟,证明P6蛋白和FvZFP蛋白能够在体内系统互作。根据实验室前期研究,蛋白酶抑制剂MG132能够抑制FvZFP蛋白介导P6蛋白的降解,本研究验证FvZFP蛋白是否具有E3泛素连接酶活性。原核表达FvZFP蛋白,体外模拟泛素系统,发现FvZFP蛋白能够结合泛素分子Ub。原核表达FvZFP蛋白和P6蛋白,体外模拟泛素系统,发现FvZFP蛋白能够泛素连接P6蛋白。试验结果表明,FvZFP蛋白介导P6蛋白的降解是利用泛素化途径实现的。2.FvZFP转基因本氏烟能够延缓P6蛋白诱导的症状发生利用叶盘法,遗传转化获得FvZFP转基因本氏烟,深入研究FvZFP蛋白功能。F3代转基因本氏烟株系的表型与野生型本氏烟无明显差异。构建PGR106-P6,P6能够诱导本氏烟叶片产生严重花叶症状。注射接种PGR106-P6,转基因本氏烟能够显著抑制花叶症状的产生。Western blot检测发现,转基因本氏烟P6蛋白表达量显著低于野生型,而P6 m RNA的表达水平一致。结果表明,FvZFP蛋白确实在蛋白水平抑制P6蛋白积累,在RNA水平对P6基因无影响,证明FvZFP蛋白抑制P6蛋白诱导的症状发生是由于抑制P6蛋白积累。3.FvZFP超表达的森林草莓抑制SVBV侵染与发病利用TRV超表达森林草莓FvZFP基因将全长FvZFP基因克隆至TRV病毒载体,利用病毒的系统侵染特性,在森林草莓体内高表达FvZFP基因。荧光定量PCR检测,TRV-FvZFP侵染森林草莓15天、25天、35天和45天后,FvZFP基因均能够上调表达3-4倍。超表达FvZFP基因能够抑制SVBV侵染利用TRV获得的超表达FvZFP基因的森林草莓继续用于功能鉴定。在接种TRV-FvZFP侵染性克隆15天后,再次接种SVBV的侵染性克隆。32天后,对照组森林草莓叶片出现严重的花叶症状;38天后,超表达FvZFP基因的森林草莓出现较轻的花叶症状。核酸和蛋白检测发现,实验组森林草莓SVBV的DNA积累量和蛋白积累量显著低于对照组,表明FvZFP能够参与SVBV的侵染过程,抑制SVBV侵染森林草莓。4.FvZFP蛋白能够影响SVBV 35S启动子活性P6蛋白能够结合SVBV 35S启动子CaMV编码的P6蛋白能够结合病毒的35S启动子,起始病毒其他基因的转录翻译。本研究根据DNA结合区域为原则,进行网站预测,将SVBV 35S启动子分为第一至第四段,分别为1-237 bp,238-491 bp,492-697 bp和698-951 bp,以满足凝胶阻滞试验要求。凝胶阻滞试验检测发现,SVBV编码的P6蛋白能够结合SVBV 35S启动子,与前人研究结果一致。FvZFP蛋白蛋白能够结合SVBV 35S启动子本研究证明P6蛋白能够与FvZFP蛋白互作,而P6蛋白又能够结合SVBV 35S启动子。根据以上研究,推测FvZFP蛋白可能影响P6与SVBV 35S启动子的结合。凝胶阻滞试验检测发现,FvZFP蛋白同样能进结合SVBV 35S启动子,表明FvZFP蛋白可能会抑制P6蛋白与SVBV 35S启动子的结合。FvZFP蛋白能够抑制SVBV 35S启动子转录GFP的能力为探究FvZFP蛋白与SVBV 35S启动子的联系,构建SVBVpro-GFP,与FvZFP共浸润本氏烟叶片。激光共聚焦观察GFP荧光表达情况,发现SVBVpro-GFP单独浸润时,GFP荧光表达很强。与FvZFP共浸润后,GFP荧光表达显著减弱。蛋白检测结果与激光共聚焦观察结果一致。