以γ-[18O4]-ATP为探针鉴定精氨酸激酶McsB的底物蛋白及异亮氨酸辅助ESI-MS2鉴定二糖异构体

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蛋白质的可逆磷酸化修饰自被发现以来,一直被认为是生物体内最重要的翻译后修饰之一。它存在于许多生物进程中,例如新陈代谢、细胞生长、细胞信号转导,在调控细胞生命活动中有着非常重要的作用。精氨酸的磷酸化是一种发生在精氨酸侧链上以P-N连接的磷酰胺修饰,但由于P-N形式的磷酸化自身高能、酸不稳定的性质使其研究一直没有取得突破性的进展。近年来随着第一个精氨酸激酶McsB的发现以及相应蛋白质组学的发展,磷酸化精氨酸的研究逐渐受到人们的重视。系统地鉴定McsB的底物不仅有助于了解磷酸化精氨酸蛋白的生物学功能,同时也有助于理解激酶McsB参与的生化过程。本论文开发了一种新的γ-[1804]-ATP稳定同位素标记对McsB底物蛋白进行系统鉴定的方法。选择嗜热脂肪芽孢杆菌的总蛋白为底物蛋白库,首次在体外通过高酶活的McsB对底物蛋白库进行高效磷酸化,经过酶切、温和的Ti02富集最终利用Nano LC-MS对McsB的底物蛋白进行了鉴定。由于γ-[18O4]-ATP对McsB底物蛋白的标记会使标记的蛋白比其他的磷酸化蛋白有6 Da的质量迁移,从而能够有效的区分激酶McsB的底物与其他磷酸化蛋白。最终我们鉴定出包含21个确定磷酸化精氨酸位点的20个磷酸化精氨酸蛋白。目前该部分的质谱鉴定工作仍在进一步优化中。综上,本论文建立了一种新的稳定同位素标记鉴定精氨酸激酶底物的方法,该方法也可以被广泛应用于其他激酶底物的鉴定中。糖是生命体重要的能量来源,同时也参与到了一系列的生物过程中。蛋白质的糖基化是另一种广泛存在的翻译后修饰形式,它在细胞间的相互作用及信号转导的过程中都起到非常重要的调控作用。同时糖类也可以与蛋白质、脂质等形成糖缀合物,这些缀合物可以作为靶标物对细胞进行锚定,同时在识别诸多生理病理的过程中起到关键作用。寡糖由于其异构体众多,目前对其异构体的区分仍然是一大挑战。本文通过研究氨基酸与二糖的弱相互作用发现异亮氨酸、二糖与钾离子形成了稳定的[Ile+Dis+K]+复合物,通过二级质谱的鉴定及数据分析,发现该复合物可以产生丰富的糖骨架的碎片结构信息。通过对八种不同的二糖异构体与异亮氨酸及钾离子复合物在ESI-MS2中形成的碎片离子峰及其峰强度的不同进行主成分分析,可以有效区分、鉴定出二糖异构体。该复合物的发现为基于多级质谱的二糖异构体的区分及鉴定提供了一种新颖的研究思路及策略。
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