芡实是睡莲科芡实属的植物,原产于东南亚和中国等。实验室前期研究发现,芡实壳提取物具有抗肿瘤、抗氧化和抑菌等功能。柯里拉京是实验室前期从芡实壳中分离纯化出的一种鞣花单宁,前人研究发现柯里拉京具有护肝、抗肿瘤、抗炎和抗氧化等多种活性作用。本文从生化因子、基因转录和蛋白表达水平三个层面考察芡实壳源柯里拉京对LPS诱导的巨噬细胞炎症反应的影响。选取合适的LPS浓度刺激RAW264.7细胞,建立炎症模型,设置正常对照组、模型组(LPS组)、实验组(LPS联合不同浓度芡实壳源柯里拉京处理组)和地塞米松阳性对照组。采用CCK-8法筛选出无显著细胞毒性的芡实壳源柯里拉京的剂量范围;Griess法测定NO含量;通过ELISA法测定TNF-α,IL-6,IL-1β,IL-10的含量,评价芡实壳源柯里拉京对炎症因子分泌量的影响;流式细胞术检测细胞内ROS含量;q-RT-PCR检测TNF-α,IL-6,IL-1β,COX-2,i NOS和NF-κB、MAPK、PI3K-AKT信号通路相关基因表达水平;Westen-Blot检测NF-κB、MAPK和PI3K-AKT信号通路相关蛋白表达量。主要实验结果如下:1.芡实壳源柯里拉京对炎症因子分泌的影响。LPS诱导的RAW264.7细胞经25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的芡实壳源柯里拉京处理后,细胞上清的NO、TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的分泌量显著降低,且呈剂量依赖性。流式细胞术检测细胞内活性氧,结果表明不同浓度的芡实壳源柯里拉京的处理,可降低LPS诱导的RAW264.7细胞ROS的含量。初步说明芡实壳源柯里拉京可通过降低LPS诱导的RAW264.7细胞中NO、TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10和ROS的含量发挥抗炎作用。2.芡实壳源柯里拉京对炎症因子基因表达的影响。采用q-RT-PCR检测TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2、i NOS基因表达量,发现经不同浓度的芡实壳源柯里拉京处理后,LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2、i NOS基因的表达量显著降低,且呈剂量依赖性。结果表明芡实壳源柯里拉京可通过减少LPS诱导的RAW264.7细胞的TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2、i NOS基因表达量发挥抗炎作用。3.芡实壳源柯里拉京对NF-κB、MAPK和PI3K-AKT信号通路相关基因和蛋白表达量影响的研究。50μmol/L的芡实壳源柯里拉京干预LPS诱导的RAW264.7细胞,q-RT-PCR检测结果显示,与模型组相比,芡实壳源柯里拉京干预组提高了NF-κB、P65、ERK、JNK、P38、PI3K和AKT基因的表达量,显著降低了IκB-α的表达量,表明芡实壳源柯里拉京可能通过NF-κB、MAPK和PI3K-AKT信号通路缓解脂多糖耐受状态,发挥免疫调节作用;Western-Blot法检测结果表明,与模型组相比,芡实壳源柯里拉京干预组下调了IκB-α的磷酸化,上调P65和JNK蛋白的磷酸化,结果表明芡实壳源柯里拉京能通过NF-κB和MAPK信号通路缓解脂多糖耐受状态,发挥免疫调节作用。