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精油降低反刍动物甲烷排放存在瞬时性。了解瘤胃微生物对精油的响应及耐受机制是发挥精油长效性的前提,具有重要的现实意义。为此,本研究以柚皮精油（Citrus essential oil,CEO）为代表,以灌注CEO不同阶段（未灌注期、响应期、耐受期和间歇期）的湖羊瘤胃液为菌源,通过体外产气试验,基于瘤胃微生物的菌群变化,探究CEO未灌注期、响应期、耐受期和间歇期瘤胃微生物对额外添加的CEO的响应;以CEO为单一碳源,筛选出耐受CEO的瘤胃微生物,根据单一菌株在CEO添加与否的培养基中的基因表达变化,探究瘤胃微生物耐受CEO机制。试验一:瘤胃微生物对CEO的响应。通过瘤胃瘘管对5只湖羊进行CEO的瘤胃灌注,前两周为日粮适应期,第3周为对照期,从第4周开始,连续灌注三周0.8mL/L的CEO,第7和第8周停灌。分别在第3周（W0NE）、第4周（W1EO）、第6周（W3EO）和第8周（W5NE）的最后一天晨饲前采集瘤胃液,获得未灌注期、响应期、耐受期和间歇期的瘤胃微生物。开展4（阶段）×2（玉米/CM和羊草/WH两种底物）×2（CEO额外添加量0和0.8 ml/L）的体外产气试验。体外发酵48 h后制备瘤胃微生物样本。荧光定量PCR结果发现,两种发酵底物下,产甲烷菌数量变化模式不同。以CM为底物时,不同阶段及CEO额外添加与否均不影响产甲烷菌数量。以WH为底物时,任何阶段额外添加CEO均显著增加产甲烷菌数量。16s扩增子测序结果发现,（1）以CM为底物时,响应期（W1EO）古菌Methanobrevibacter gottschalkii和细菌 Treponema 2、Succinivibrio的相对丰度降低,古菌Methanobrevibacterruminantium 和细菌 Olsenella、Oribacterium、Streptococcus 相对丰度升高,CH4产量下降。耐受期（W3EO）Mbb.gottschalkii、Succinivibrio和Treponema 2的相对丰度升高,CH4产量上升。间歇期（W5NE）Succinivibrio相对丰度较耐受期不变但低于初始阶段,Treponema2相对丰度较耐受期不变但高于初始阶段,Stretococcus、Olsenella相对丰度较耐受期与初始阶段无显著差异。以 WH 为底物时,响应期 Mbb.gottschalkii、Succinivibrio、Ruminococcus 2、Ruminococcaceae 的相对丰度降低,Mbb.ruminantium、Ruminococcus 1 和Treponema2等相对丰度升高,CH4产量下降。在耐受期Mbb.gottschalkii持续降低,Succinivibrio、Ruminococcus 2相对丰度升高,CH4产量上升。间歇期Ruminococcus2相对丰度较耐受期升高并高于初始阶段,Streptococcus、Prevotella 1相对丰度较耐受期升高但与初始阶段相比无显著差异,Ruminococcus 1相对丰度较耐受期无差异但高于初始阶段。（2）额外添加CEO,不同阶段无论以CM或WH为底物时,古菌Mbb.gottschalkii相对丰度降低,CH4产量下降。以CM为底物时,响应期、耐受期和间歇期细菌Streptococcus和Oribacterium相对丰度升高,Succinivibrio、Treponema2相对丰度下降,耐受期Ruminococcus 1相对丰度升高。以WH为底物,不同阶段Treponema2相对丰度下降,响应期、耐受期和间歇期Prevotella1相对丰度下降,响应期Succinivibrio相对丰度上升,耐受期Ruminococcus 1相对丰度上升,响应期和间歇期Olsenella和Ruminococcus 2相对丰度上升。上述结果表明,CEO对瘤胃微生物存在选择性压力,不同瘤胃环境（底物）下,响应和耐受CEO的微生物不同。以CM为底物时,古菌Mbb.gottschalkii、Mbb.ruminantium 和细菌 Treponema 2、Succinivibrio、Olsenella、Oribacterium、Streptococcus等快速响应,CH4产量降低。而持续CEO供应时,Mbb.gottschalkii和Treponema2、Succinivibrio的相对丰度呈相反变化,CEO的降甲烷效果减弱;以 WH 为底物时,Mbb.gottschalkii、Mbb.ruminantium、Succinivibrio、Ruminococcus 2、Ruminococcaceae、Ruminococcus 1、Treponema 2 等快速响应,CH4 产量降低,而持续CEO供应时,Mbb.gottschalkii相对丰度持续降低,Succinivibrio、Ruminococcus2的相对丰度呈相反变化,CEO的降甲烷效果略微减弱。停止灌注CEO使细菌组成部分恢复至初始期,细菌耐受现象减弱,Ruminococcus 2、Prevotella 1和其他细菌重新对CEO敏感,CEO的降甲烷效果部分恢复。试验二:探究单一菌株的CEO耐受机制。以CEO为唯一碳源,通过多次传代培养筛选出耐受CEO的瘤胃微生物单菌。以不含CEO培养基为对照组/NCEO组,添加CEO培养基为试验组/CEO组,进行两组原核转录组测序,并对比分析两组差异基因的表达情况。结果发现:（1）测序鉴定以CEO为唯一碳源筛选出的单一菌株是产酸克雷伯菌（Klebsiellaoxytoca）。（2）原核转录组共检测到507个差异表达基因,CEO组中上调的有301个,其中噬菌体休克蛋白基因pspABCDEG、蛋白酶基因htpX、杆状决定蛋白基因rodA、杆状决定蛋白基因mreC、阻遏蛋白基因cpxP等细胞膜修复、肽聚糖合成与修复、耐药性相关的功能基因显著上调。（3）GO分析结果显示,所有差异表达基因一共富集到26条GO条目。CEO组中上调基因显著富集到有机氮化合物代谢过程、有机氮化合物生物合成过程和细胞酰胺代谢过程等生物过程,铁离子结合、金属离子结合等分子功能,细胞质、细胞内等分子结构生物过程。（4）KEGG代谢通路分析结果显示,CEO组中上调基因显著富集到核糖体、丙酸代谢和生物合成抗生素途径,下调基因显著富集到ABC转运蛋白途径。（5）基因结构分析结果显示噬菌体克蛋白（Phage shock protein,Psp）操纵子相关基因表达水平显著高于对照组。结果表明,CEO可能通过损伤细胞膜方式杀伤细菌,K.oxytoca通过上调pspABCDEG、htpX、rodA、mreC、cpxP等基因表达维持细胞膜完整性,通过细胞成分合成途径修复胞膜损伤以及通过丙酸代谢途径降解利用烯类物质耐受CEO。综上,本研究表明CEO的添加会改变细菌和古菌的菌群结构,不同底物响应和耐受 CEO 的微生物不同。Mbb.gottschalkii、Mbb.ruminantium、Treponema 2、Butyrivibrio 2、Ruminococcus 2、Ruminococcaceae、Streptococcus 能迅速响应CEO,引起 CH4 产量下降。Treponema2、Succinivibrio和Ruminococcus2能耐受CEO,引起CEO降甲烷效果减弱。CEO可能通过破坏细胞壁完整性、损伤细胞膜、减少主动转运、直接造成细胞损伤。激活胞膜应激反应、耐药性机制、促进细胞成分合成以及丙酸代谢途径是K.oxytoca耐受CEO的可能机制。