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目的1.本研究应用RNA-seq技术检测初治重型再生障碍性贫血（Severe aplastic animia,SAA）患者、正常对照外周血CD8+T细胞中的长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）和信使RNA（messager RNA,m RNA）的表达变化。通过生物信息学,分析差异表达lncRNAs的作用靶基因,基因本体（Gene Ontology,GO）功能注释及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析靶基因参与的关键生物学过程及信号通路。以进一步验证并阐明关键lncRNA在CD8+T细胞激活过程中的作用,为完善SAA的免疫发病机制及探索新的治疗靶点提供依据。2.探讨免疫相关性全血细胞减少症（Immune-related pancytopenia,IRP）患者中CD56bright自然杀伤细胞（CD56bright NK）的数量、功能变化及其在IRP免疫发病机制中的作用并探索NK细胞高效的体外扩增培养方法,为研究NK细胞免疫治疗奠定基础。方法第一部分:应用高通量组学方法检测初治SAA患者及正常人外周血CD8+T细胞中m RNAs及lncRNAs的表达变化,并对差异表达的m RNAs进行GO及KEGG聚类分析,分析m RNAs可能参与的关键生物学功能及信号通路。同时对筛选得到的差异表达的lncRNAs进行靶基因预测,并对靶基因进行GO和KEGG分析,由此预测lncRNA可能调控的功能。第二部分:qRT-PCR验证筛选得到的关键lncRNAs及其预测调控的靶基因m RNAs的表达变化。应用流式细胞术（FCM）检测SAA患者中CD8+T中的穿孔素、颗粒酶B的表达水平。将差异表达lncRNAs与穿孔素、颗粒酶B的表达水平做相关性分析,将lncRNA-AF117829.1表达水平与患者临床指标做相关性分析。第三部分:应用慢病毒载体过表达SAA患者及正常对照CD8+T细胞内lncRNA AF117829.1水平,RT-PCR检测过表达后CD8+T细胞内lncRNA AF117829.1和m RNA RIP2的水平变化;流式细胞术检测过表达后CD8+T细胞内穿孔素和颗粒酶B的表达变化及凋亡水平变化。Western-blot检测过表达后RIP2信号通路蛋白水平的变化。第四部分:应用RIP2激酶抑制剂GSK583体外干预SAA患者外周血CD8+T细胞,Western blot检测GSK583干预后RIP2信号通路蛋白的表达变化;流式细胞术检测GSK583干预后CD8+T细胞内穿孔素和颗粒酶B的变化水平及凋亡水平变化。第五部分:流式细胞术（FCM）分析IRP患者免疫抑制治疗（IST）前后外周血CD56bright NK细胞数量及功能的变化。流式细胞术检测CD56bright NK细胞表面活化性受体（NKG2D、NKp46和NKp44）、抑制性受体（NKG2A、CD158a和CD158b）及穿孔素、颗粒酶B的表达。ELISA法检测血清中IL-2、IL-18水平。并分析NK细胞数量功能变化与IRP患者临床指标的相关性。第六部分:免疫磁珠分选6例IRP患者外周血中的NK细胞,在重组Il-2和IL-5的基础上联合NK细胞扩增剂进行NK细胞扩增。流式细胞术检测NK细胞培养前后活化性受体NKG2D和NKp46及抑制性受体CD158a和NKG2A的表达水平变化。结果第一部分:1.应用RNA-seq技术对初治SAA患者和健康对照者CD8+T细胞的lncRNAs及m RNAs表达谱进行分析（差异满足2倍,P小于0.05）,共有2099个m RNAs的表达发生变化（1104个m RNAs表达上调,995个m RNAs表达下调）。GO分析结果提示差异m RNAs大多参与催化、转导活性、分子功能调节、细胞代谢、免疫系统等生物学过程。KEGG结果显示差异表达的m RNAs主要富集到JNK信号通路、RAS信号通路、NOD2/RIP2信号通路以及MAPK等信号通路。共有194个lncRNAs的表达发生变化（107个lncRNAs表达上调,87个lncRNAs表达下调）。生物信息学预测差异表达lncRNAs的作用靶基因及其参与的关键生物学过程和信号通路,GO结果显示差异表达lncRNAs多与细胞器成分、催化活性、对刺激的反应、细胞内外信号转导、代谢过程等生物学过程有关;KEGG结果显示差异表达lncRNAs多与泛素介导的蛋白质组学、抗原处理和呈递、NOD等信号通路有关。第二部分:本研究中lncRNA AF117829.1的预测靶基因为RIP2,其中m RNA RIP2满足高通量组学检测差异表达条件（差异满足2倍,P小于0.05）。qRT-PCR检测lncRNA AF117829.1在初治SAA患者中表达减低,m RNA RIP2的表达水平增高,结果与基因芯片结果一致。同时Western-blot检测RIP2信号通路相关蛋白发现明显升高。LncRNA AF117829.1与穿孔素,颗粒酶B的表达水平呈明显负相关,与临床指标呈明显相关性。第三部分:慢病毒过表达SAA患者CD8+T细胞中lncRNA-AF117829.1后,通过qRT-PCR检测m RNA-RIPK2的表达水平,发现较对照组表达降低;流式检测发现CD8+T细胞的穿孔素、颗粒酶的表达水平降低;Western blot结果显示RIP2信号通路相关蛋白表达水平减低。第四部分:GSK583体外干预SAA患者外周血CD8+T细胞后,Western blot检测发现RIP2信号通路相关蛋白减低,流式细胞术检测发现CD8+T细胞的穿孔素、颗粒酶B表达水平降低。第五部分:初治IRP患者外周血中CD56bright NK细胞比例显著高于正常对照组,其表面NKG2D表达水平高于正常对照组,CD158a表达水平低于正常对照组。初治IRP患者外周血中CD56bright NK细胞比例与颗粒酶B乘积明显高于对照组。同时,初治IRP患者血清中IL-2、IL-18水平均高于正常对照组。第六部分:NK细胞扩增剂联合重组IL-2、重组IL-15可在保持NK细胞纯度基础上增加NK细胞数量。IRP患者NK细胞扩增前后NKG2D、NKp46、NKG2A、CD158a的表达水平无明显变化。结论1.从组学层面系统描述了lncRNA以及m RNA的表达变化及其可能参与的生物学功能及信号通路,其中SAA中CD8+T细胞中lncRNA AF117829.1的低表达可能通过促进靶基因RIP2表达而调控CD8+T细胞的功能,进一步了解SAA免疫发病的分子机制,为SAA的诊断和治疗提供潜在的靶点。2.IRP患者外周血CD56bright NK细胞数量增加、功能亢进,可能在IRP的发病机制中发挥重要作用。3.NK细胞扩增剂联合重组IL-2、重组IL-15的扩增方法可在保持NK细胞纯度基础上增加NK细胞数量,对NK细胞功能无明显影响,为研究NK细胞免疫治疗奠定了基础。